SONDAS GENICAS

SONDAS GÉNICAS
I. Definición
Una sonda es un fragmento de ADN (o raramente ARN) de pequeño tamaño (normalmente entre 100 y 1000 bases) usado en biología molecular como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual. En su uso, la sonda se une a la secuencia diana monocatenaria (ADN/ARN) mediante un mecanismo de hibridación que forma unaestructura bicatenaria, una de las hebras pertenece a la sonda, y la otra a la secuencia diana. Esta unión se establece porque tanto la sonda como la diana tienen secuencias en parte o totalmente complementarias, formándose pares de bases complementarias
Bioquímicamente una sonda es una molécula de ADN o ARN homologa a una secuencia de ARN o ADN diana, con la que híbrida de forma estable y especifica (porasociación de bases complementarias). La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN o ADN y se unirá exclusivamente esa secuencia de la que es copia. Esto es lo que se llama especificidad de la sonda. Una vez que la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica. La detección solo es posible si la sonda se ha marcado con un grupo detectable. Dependiendo del número deestos grupos incorporados y de la señal que emitan la sonda puede tener diferente sensibilidad.
II. Tipos de sondas
Distintos tipos de sondas de ácidos nucleicos pueden ser utilizadas para la hibridación in situ:
1. Sondas de DNA de doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando técnicas como “nick translation, random priming o PCR”, en las cuales el nucleótido marcado es incorporado. PCR y randompriming proporcionan una buena actividad específica. Estas sondas pueden ser desnaturalizadas antes de usar. Cuando se usan para detectar una cadena simple como mRNA, estas son menos sensibles debido a que la concentración de la sonda marcada es reducida.
2. Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas utilizando “primer extension” en templados de cadena simple o por PCR con unnucleótido marcado. Éste último es el más usado porque es más fácil de llevar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad de material.
3. El PCR permite una gran flexibilidad en la elección de las secuencias marcadas por el uso de primers. Estas marcas han sido ampliamente usadas.
4. Oligonucleótidos (entre 20 y 40 bases). Son marcados incorporando oligonucleótidos modificados durantela síntesis química o adicionando una cola marcada. Una de las desventajas es que algunos oligonucleótidos marcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye.
5. Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso de una RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de la sonda es clonada en un vector que flanqueará dos sitios distintos de iniciación.
6.La cadena de RNA anti sentido (sonda) es sintetizada en dirección opuesta al gen endógeno. Se recomienda linearizar la sonda de RNA con enzimas que dejen el extremo 5’ cohesivo, porque se ha reportado, que el extremo 3’ romo promueve la síntesis de transcritos anormales.
III. Clases de marcaje para visualización de las moléculas Dianas.
Para visualizar las moléculas diana se utiliza una sondamarcada, bien radiactivamente, o mediante marcaje inmunológico. Para el uso de ADN de doble cadena primeramente es necesario desnaturalizarlo mediante calor o en condiciones de alta alcalinidad. Esta sonda de cadena simple marcada se une a la diana; y los lugares de unión se detectan porque los métodos de marcaje dejan una señal detectable mediante fotografía. En los métodos más avanzados se utilizanmarcajes mediante fluorescencia que emiten señales detectadas mediante làser, como el utilizado en la PCR a tiempo real.
a. Radiactividad:
Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizado nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo.
El isótopo más utilizado es el P32, con alta actividad específica (9200 Ci/mmol puro) y emite partículas de alta energía (1'7 MeV) por...