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TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
Transformación de E. coli con ADN plasmídico.
Introducción:
La transformación bacteriana es un proceso por el cual una bacteria competente incorpora DNA foráneo (tanto de su misma especie como de otra) pudiendo utilizarlo, conservarlo o degradarlo. Este proceso es común en muchas especies para aumentar su variabilidad genética y para la adquisición de nuevascaracterísticas que les permitan sobrevivir en un determinado ambiente.
Para que la molécula de ADN introducida pueda replicarse en la bacteria, la misma debe ser circular, pequeña y poseer un origen de replicación bacteriano. Esta estructura recibe el nombre de plásmido. Los plásmidos pueden contener a su vez de uno a unos pocos genes que codifiquen para proteínas. Si las mismas son esenciales para lasupervivencia de la bacteria (por ejemplo le confieren resistencia a un antibiótico presente en el medio) se dice que existe una presión de selección que determinará que las bacterias que sobrevivan sean las que conservaron el plásmido.
Aprovechando esta posibilidad de aislar las bacterias transformadas suprimiendo las wild type mediante su cultivo en un medio seleccionador (como es el caso denuestra experiencia) se desarrollaron varias técnicas de laboratorio que sentaron las bases de la ingeniería genética.
Una variable esencial en estas técnicas es el grado de competencia de las bacterias a utilizar. Sin embargo la competencia también puede inducirse mediante técnicas de laboratorio donde, básicamente, se debilitan las bacterias para volverlas más susceptibles a la incorporación delplásmido.
Objetivos:
Transformar bacterias de la especie Escherichia coli con el plásmido purificado en el TP2, confiriéndoles a las mismas resistencia a ampicilina.
Calcular la eficiencia de transformación de nuestra experiencia y estimar con ello la concentración de plásmido purificado.
Materiales:
Tres tubos con 50 µl de solución de bacterias Escherichia Coli, CaCl2 y LB.
Tres placas de Petriesterilizadas con LB sólido y ampicilina.
Solución de plásmido control: 5 µl de plásmido pBluescript 2x10-3 µg/ µl
Solución de plásmido pBluescript purificado en el TP2
Agua Estéril
Metodología:
Para volver a las bacterias competentes, se resuspenden las mismas en una solución de cloruro de calcio (CaCl2) fría con la solución de plásmido, que consigue, por un lado, neutralizar lascargas negativas de los grupos fosfatos del ADN y de los fosfolípidos de membrana (debido a la presencia del catión Ca+2) y, por otro, disminuye la fluidez de la membrana (debido a la baja temperatura). En conjunto, esto permite que las moléculas de ADN se aproximen a las membranas bacterianas.
Sin embargo, este paso no se llevó a cabo en el laboratorio, ya que las bacterias competentes fueronentregadas por los docentes.
Luego, se provoca un shock térmico de 90’’ a 42 ºC que desestabilizará parcialmente la membrana (aumenta bruscamente la fluidez) generando poros por los que ingresarán los plásmidos a la bacteria. El tiempo en este paso es muy importante, ya que con uno menor la transformación no resultaría efectiva, mientras que extenderlo derivaría en la muerte progresiva de lasbacterias.
Por ultimo se las vuelve a incubar a 0 ºC por cinco minutos, para aumentar la eficiencia. Este paso se basa en observaciones experimentales sobre el perfeccionamiento de las técnicas de transformación.
Antes de poder sembrar nuestras bacterias transformadas, debemos incubarlas por 30’ a 37 ºC, en LB sin antibiótico (medio óptimo) para que puedan expresar el gen presente en el plásmido queles conferirá la resistencia a la ampicilina.
Una vez completado el paso anterior, se prosiguió a plaquear las bacterias en placas de petri esterilizadas y con LB, agar y ampicilina. Esto debe realizarse en un medio estéril por lo que se desinfectó la mesada de trabajo, se esterilizó mediante fuego el rastrillo y se trabajó siempre cerca de un mechero encendido.
Finalmente se deja reposar...