Subclonamiento y Expresion Genica

Páginas: 22 (5257 palabras) Publicado: 30 de septiembre de 2011
1.- INTRODUCCIÓN
En el informe anterior se describió el proceso de amplificación por PCR de un gen de interés (gen sod de Acidithiobacillus ferrooxidans), el clonamiento del mismo utilizando un vector topo, su inserción a una cepa quimocompetente de Eschericha coli, la selección de las colonias transformadas a partir del cultivo en placas y la purificación de los DNA plasmidiales, tanto delvector pTOPO y como del vector de expresión pet15b.
Una vez purificados ambos vectores (clonamiento y expresión), se digiere el vector de clonamiento utilizando dos enzimas de restricción (XhoI y NdeI) para producir dos fracciones del plasmidio, una que contiene el gen de interés y otra que deja al vector pTOPO linealizado.
Con las mismas enzimas de restricción se digiere el vector de expresión,para generar extremos cohesivos entre el gen sod y el vector de expresión, garantizando la incorporación correcta y unidireccional de la ligación. Tras la ligación se transformó una nueva cepa de E. coli, esta vez a través de métodos físicos, electroporación. Finalmente, se seleccionan los clones positivos utilizando PCR, para inducir la expresión del vector usando IPTG y con el objeto de verificarla producción de superóxido-dismutasa por la cepa transformada utilizando un gel para la electroforesis de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio.

Objetivos:
* Ligar el gen de interés al vector de expresión.
* Transformar una cepa de E. coli con el producto de la ligación.
* Seleccionar clones positivos.
* Inducir la expresión del vector de expresión usando IPTG.
*Evaluar la producción de la proteína producida por el gen de interés.


2.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Digestión enzimática del DNA plasmidial pTOPO/SOD y purificación del fragmento clonado.
Materiales
2.1.1.- Digestión preparativa del DNA plasmidial de pTOPO/SOD y pET15b. (Realizada por ayudantes)
DNA pTOPO/SOD | μL (aprox 2 μg) |
XhoI | 0,5 μL (5U) |
NdeI | 1,0 μL (10U) |
Buffer 0| 6,0 μL |
Agua MiliQ | μL |
Volumen total | 60 μL |

DNA pET15b | μL (aprox 2 μg) |
XhoI | 0,5 μL (5U) |
NdeI | 1,0 μL (10U) |
Buffer 0 | 6,0 μL |
Agua MiliQ | μL |
Volumen total | 60 μL |

2.1.2.- Digestión analítica DNA plasmidial.
DNA pTOPO/SOD | 2 μL (aprox 500 ng) |
XhoI | 0,25 μL (2,5U) |
NdeI | 0,25 μL (2,5U) |
Buffer 0 | 1,0 μL |
Agua MiliQ | 6,5 μL |Volumen total | 10 μL |

-12 μL Bufer de carga 6x
-Gel de agarosa al 1%
-Estándar (Gene Ruler DNA Ladder mix, (fermentas))
2.1.3.- Purificación del fragmento clonado.
-2 Kit Ultrafree-DA de Milipore (DNA Extraction from agarose gels)
-Banda cortada del gel de agarosa de digestión preparativa del DNA plasmidial de pTOPO/SOD (gen sod) y banda cortada del gel de agarosa de digestión preparativadel DNA plasmidial de pET15b (vector linealizado).

Métodos
Digestión analítica DNA plasmidial.
Durante incubación se prepara un gel de agarosa al 1% en buffer TAE 1X con bromuro de etidio 1 μg/mL.
Se incuba el tubo con la mezcla por 1 hora a 37°C

En un tubo eppendorf se adiciona el DNAp, XhoI, NdeI, Buffer 0 y Agua MiliQ.

Una vez terminada la electroforesis se observa en untransiluminador UV y se saca una foto.
En un pocillo se carga el estándar y en el pocillo siguiente la mezcla de incubación con el buffer.
Terminada la incubación se agrega 12 μL de buffer de carga 6x y se hace un spin

Purificación del fragmento clonado Se prepara el sistema Ultrafree-DA de Millipore como se muestra en la Figura 2.1

En el tubo2, Gel Nebulizer, se introduce el trozo del gel y setapa

Se toma el trozo del gel de agarosa entregado por los ayudantes que corresponde al gen sod

Se repite el procedimiento para la banda del gel con el plasmidio pET15b linealizado

Se Centrifuga por 10 minutos a 5000 g
Se eliminan tubos 2 y 3. El tubo 4 donde se encuentra purificado el DNA y buffer de electroforesis es guardado para la siguiente experiencia.

Figura 2.1.- Sistema...
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