Subcultivo
Páginas: 9 (2235 palabras)
Publicado: 7 de julio de 2012
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SEDE MEDELLÍN
Subcultivo y cosecha de líneas celulares
Junio (19), 2012
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Resumen
Los subcultivos presentan gran importancia en la industria y a nivel científico, porque permiten originar líneas celulares, necesarias para diversos ensayos en laboratorio.Durante la práctica se realiza el mantenimiento y subcultivo de elementos de la línea celular CHO (Chinese Hamster Ovary). Se emplea el medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con SBF, en presencia del indicador Rojo de Fenol que está incluido en el medio y da una idea del estado de salud del cultivo. Se efectúa el pase de un cultivo prexistente a través de un protocolo estándar que incluye retirarsobrenadante, hacer lavados, tripsinizar para separar las células del sustrato y finalmente realizar la división del cultivo. La viabilidad celular se verifica con hemocitometro de Neubauer o por observación directa en el microscopio óptico para evaluar el número de cromosomas presentes en la muestra.________________________________________________________________________________________________________________________
1. Introducción
Luego de la siembra o cultivo primario hay una fase de latencia seguida de una fase log o de crecimiento exponencial celular. Cuando todo el sustrato es ocupado el crecimiento se reduce y es necesario realizar un cambio de medio o el cultivo debe dividirse; esto último implica realizar el subcultivo de una línea adherente. Luego del subcultivo, elrecrecimiento de las células es estándar hasta el crecimiento donde se requiere realizar otro subcultivo.
- Subcultivo
Los subcultivos son una etapa de transición importante en los cultivos. El cultivo primario debe ocupar todo el sustrato disponible. Luego del primer subcultivo la tasa de crecimiento suele ser alta (80% o más). A partir del cultivo primario heterogéneo, se obtiene un conjuntomás homogéneo al subcultivar, originando una línea celular. Si la línea celular es transformada in vitro origina una línea celular continua. Si es seleccionada, clonada y caracterizada se denomina cepa celular continua. La necesidad de un nuevo subcultivo está determinada por los siguientes parámetros:
1. Densidad del cultivo
2. Agotamiento del medio.
3. El tiempo desde elúltimo subcultivo.
4. Requerimiento de cultivo para otros procedimientos.
El primer subcultivo origina un cultivo secundario, que origina uno terciario y así sucesivamente, aunque en la nomenclatura se habla de hasta terciario.
El numero de pases es el número de veces que el cultivo ha sido subcultivado, mientras que el numero de generaciones es el numero de divisiones que lascélulas han efectuado. El número de pases es aproximadamente igual al número de generaciones. Si el subcultivo se efectúa con tasas de división superiores a 1:2 veces el número de generación, el cual es un indicador significativo de la edad del cultivo, el aumento celular será mayor que el número de pases. La aproximación no tiene en cuenta la perdida por necrosis, apoptosis o senescencia prematura.- Tripsinización
Es el proceso de usar tripsina, una enzima proteolítica que rompe proteínas, para disociar las celular adheridas al sustrato. Es empleada frecuentemente para subcultivar células, hacer observaciones experimentales o reducir el grado de confluencia celular por disminución del porcentaje de células.
Las líneas celulares continuas ofrecen un conjunto importante deventajas al momento de subcultivar. La línea empleada en la práctica es la línea CHO. Este es el acrónimo de Chinese Hamster Ovary, de donde se origina esta línea ampliamente empleada en biología molecular, transfección, expresión y producción de proteínas recombinantes a gran escala. T. Puck obtuvo una muestra de Hámster Chino de un laboratorio del Boston Cáncer Research Foundation, y la uso...
SEDE MEDELLÍN
Subcultivo y cosecha de líneas celulares
Junio (19), 2012
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Resumen
Los subcultivos presentan gran importancia en la industria y a nivel científico, porque permiten originar líneas celulares, necesarias para diversos ensayos en laboratorio.Durante la práctica se realiza el mantenimiento y subcultivo de elementos de la línea celular CHO (Chinese Hamster Ovary). Se emplea el medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con SBF, en presencia del indicador Rojo de Fenol que está incluido en el medio y da una idea del estado de salud del cultivo. Se efectúa el pase de un cultivo prexistente a través de un protocolo estándar que incluye retirarsobrenadante, hacer lavados, tripsinizar para separar las células del sustrato y finalmente realizar la división del cultivo. La viabilidad celular se verifica con hemocitometro de Neubauer o por observación directa en el microscopio óptico para evaluar el número de cromosomas presentes en la muestra.________________________________________________________________________________________________________________________
1. Introducción
Luego de la siembra o cultivo primario hay una fase de latencia seguida de una fase log o de crecimiento exponencial celular. Cuando todo el sustrato es ocupado el crecimiento se reduce y es necesario realizar un cambio de medio o el cultivo debe dividirse; esto último implica realizar el subcultivo de una línea adherente. Luego del subcultivo, elrecrecimiento de las células es estándar hasta el crecimiento donde se requiere realizar otro subcultivo.
- Subcultivo
Los subcultivos son una etapa de transición importante en los cultivos. El cultivo primario debe ocupar todo el sustrato disponible. Luego del primer subcultivo la tasa de crecimiento suele ser alta (80% o más). A partir del cultivo primario heterogéneo, se obtiene un conjuntomás homogéneo al subcultivar, originando una línea celular. Si la línea celular es transformada in vitro origina una línea celular continua. Si es seleccionada, clonada y caracterizada se denomina cepa celular continua. La necesidad de un nuevo subcultivo está determinada por los siguientes parámetros:
1. Densidad del cultivo
2. Agotamiento del medio.
3. El tiempo desde elúltimo subcultivo.
4. Requerimiento de cultivo para otros procedimientos.
El primer subcultivo origina un cultivo secundario, que origina uno terciario y así sucesivamente, aunque en la nomenclatura se habla de hasta terciario.
El numero de pases es el número de veces que el cultivo ha sido subcultivado, mientras que el numero de generaciones es el numero de divisiones que lascélulas han efectuado. El número de pases es aproximadamente igual al número de generaciones. Si el subcultivo se efectúa con tasas de división superiores a 1:2 veces el número de generación, el cual es un indicador significativo de la edad del cultivo, el aumento celular será mayor que el número de pases. La aproximación no tiene en cuenta la perdida por necrosis, apoptosis o senescencia prematura.- Tripsinización
Es el proceso de usar tripsina, una enzima proteolítica que rompe proteínas, para disociar las celular adheridas al sustrato. Es empleada frecuentemente para subcultivar células, hacer observaciones experimentales o reducir el grado de confluencia celular por disminución del porcentaje de células.
Las líneas celulares continuas ofrecen un conjunto importante deventajas al momento de subcultivar. La línea empleada en la práctica es la línea CHO. Este es el acrónimo de Chinese Hamster Ovary, de donde se origina esta línea ampliamente empleada en biología molecular, transfección, expresión y producción de proteínas recombinantes a gran escala. T. Puck obtuvo una muestra de Hámster Chino de un laboratorio del Boston Cáncer Research Foundation, y la uso...
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