Técnica de Wetern Blot

Técnica Western Blot

Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, permite la detección de unasola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra me-diante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la pro-teína de interés.Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para compararcuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. Esta guía de laboratorio describe los pasos involucrados en la realización de un Western blot, incluyendo la preparación de muestras, la separación deproteínas, la transferencia y la detección.

Western Blot: Visión General
a. Preparación de la muestra
Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química.b. Electroforesis en gel de Acrilamida
Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis.
Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida. El dodecilsulfatode sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere, de forma proporcional a la masa de cada proteína, una carga negativa a cada una de ellas.

c. Transferencia electroforética a unamembrana
Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana, dónde quedan inmovilizadas.

d. Hibridación del Anticuerpo
La membrana con las proteínas inmovilizadas debetratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopoespecífico de la proteína diana. Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de...