Técnicas De Biología Molecular

Extracción de acidos nucleicos por solubilidad en fases inmiscibles.
Dada su complejidad macromolecular, los acidoa nucleicos son difíciles de separar de los componentes de membrana. Los métodos drásticos alteran sus estructuras y sus características. Muchos métodos suaves elaborados para eliminar la impureza de las preparaciones, todo ellos basado s en las propiedades físico-quimicos del acidonucleico. Para eliminación de proteínas asociadas se utilizan enzimas proteolíticas, como la proteinasa k.
Extracción del DNA
el protocolo básico consiste en el tratamiento el homogenado con disolventes organicos (fenol, cloroformo o ambos)
1- Extracción: Muestra(acuosa), fenol, cloroformo.
-mezcla por agitación, centrifugación.
-en la fase acuosa superior, menos densa) quedan disueltosDNA y RNA.
-las proteínas desnaturalizadas por el cloroformo y el fenol, se situan en la interfase.
-en la fase organica (inferior,mas densa) quedan los lípidos de membrana.
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2- purificación por precipitación
* fase acuosa, 1 vol. De etanol absoluto o de isopropanol
* Al irse mezclando el alcohol insolubiliza el DNA, que va quedando en forma de fibras que se enrollan en la varilla.* Extracción con varilla

1- Procedimientos alternativos
-muestra(acuosa), cloroformo, alcohol isoamilico.
-mezcla por agitación,centrifugación.
-en la fase acuosa (superior, menos densa), quedan disueltos DNA y RNA.
-el alcohol isoamilico favorece la separación nítida de las fases.
-las proteínas desnaturalizados por el cloroformo, se situan en la interfase.
-en la faseorganica(inferior, mas densa) quedan los lípidos de membrana.
2- purificación por precipitación
--fase acuosa, 1 vol. De etanol absoluto o de isopropanol
-centrifugacion
-en presencia del alcohol el DNA en insoluble.
Purificación de acidos nucleicos por precipitación salina diferencial.
Se trata de un procedimiento alternativo, basado en las diferenciales de solubilidad de DNA y RNA en función de laconcentración de sales: tanto de DNA son solubles en disolución salina concentrada, mientras que a baja concentración de sales solo es soluble el RNA.
Para esta precipitación salina se suele utilizar NaCl, también se utiliza acetato sódico saturado, en combinación con alcoholes organicos, conduciendo a resultados incluso mejores que con fenol y cloroformo, sobre todo para cantidades pequeñas de DNA.Recogida y conservación de las muestras
Una vez separados y extraidos, los acidos nucleicos deben ser conservados adecuadamente. El precipitado seco de acidos nucleicos o el “ovillo” de fibras de DNA obtenido con la varilla pueden disolverse en disolución amor amortiguadora (alcalina, en el caso del DNA) y conservarse a 4 C, disolverse en agua y mantenerse congelados para posterioresmanipulación enzimáticas. El DNA genómico en disolución no se debe congelar, para evitar la rotura de las moléculas por las fuerzas de cizalla provocadas al solidificarse el hielo y al descongelarse, el RNA si puede cosnservarse congelado a -70 C en disolución acuosa, añadir un inhibidor de RNasas.
Procedimientos alternativos: extracción o análisis directos del DNA.
Puede estudiarse el DNA de lasmuestras sin necesidad de manipulación alguna, salvo la lisis de las células. Este es el caso de la amplificación y detección del DNA de la muestra sin necesidad de manipulación alguna, salvo la lisis de las células. Este es el caso de la amplificación y detección del DNA mediante la técnica de PCR, cada vez es mas frecuente y eficaz la extracción directa del DNA, con lo que el DNA Y RNA se puedenextraer de forma directa a partir de muestras heterogeneas y de pequeño volumen.
También se emplean cada vez mas microesferas magneticas, análogas a las de separación celular, sobre cuya superficie se adsorben directamente los acidos nucleicos o se unen de forma covalente otras moléculas por afinidad por ellos.
Fraccionamiento de los acidos nucleicos
Ultracentrifugacion:
Este método se basa en...