Técnicas de biología molecular

Doctorado en Ciencias Biomédicas de la Universidad Veracruzana Bioquímica

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1. Se requiere preparar una solución de lisis 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM Na3VO4, 0.1% NP-40, 0.1% sodiumdeoxycholato pH 7.4. Si en su trabajo semanal empleará aproximadamente 20 ml de esta solución, a razón de 4 ml diarios ¿Cómo prepararía este amortiguador? Basándome en loscálculos realizados, seguiría éstos pasos:    Disolver 121.1 mg de Tris en 5 mL de agua y llevarlo a pH de 7.4 con HCl. En 10 mL de agua disolver 175.5 mg de NaCl, 42 mg de NaF, 53.18 mg de Na 4P 2O7 y 3.078 de Na3VO4. Se mezclan las dos soluciones anteriores y se le adicionan 20 µL de NP-40 y 0.2 mg de deoxicolato de sodio.

2. ¿Porqué la solución anterior es una solución de lisis? ExpliqueLa mezcla preparada es una solución de lisis porque el detergente NP40 destruye la membrana citoplasmática de la célula, lo cual trae descontrol en los gradientes y demás procesos celulares. 3. Describa paso a paso las siguientes técnicas: Western Blot El Western Blot es un método para identificar proteínas en una mezcla compleja de proteínas, transfiriendo las proteínas separadas mediante el pesomolecular, de un medio gelificado a una membrana de nitrocelulosa de unión de las proteínas para su análisis. I.- Extracción de Proteínas 1. Las células se lavarán con PBS y se resuspenderán en 250 µl de buffer de lisis con inhibidores de proteasas y se incubarán en hielo por 15 min. 2. Después, las células se cosecharan raspándolas y haciendo un homogenado celular, el cual se centrifugará a13000 rpm durante 10 min a 4ºC. 3. Recuperar el sobrenadante y tomar una alícuota para cuantificar la concentración de proteína total por el método de Bradford. II.- Cuantificación de proteínas por el método de Bradford o el utilizado en cada laboratorio.

Se requiere conocer en qué volumen de homogeneizado celular se tiene 50 µg de proteínas.
María de la Soledad Lagunes Castro

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III.- Preparación del Gel.

a) Limpiar cuidadosamente los vidrios para hacer los geles. b) Considerar las cantidades indicadas para la preparación de 2 geles. c) En un vial colocar los reactivos para hacer el gel de corrida, agitar suavemente, tener cuidado al poner el persulfato casi inmediatamente vaciar la solución ya que seinicia la gelificación en algunos minutos, dejar reposar 10-15 min para gelificación completa. d) Posteriormente, preparar en otro vial la solución para el gel concentrador (cuidado al agregar el persulfato, ya que gelificará casi inmediatamente) y colocar el peine, dejar reposar de 10-15 min. e) Una vez que está listo el gel, se recomienda hacer una corrida previa a 200 volts. durante 30 min, antesde agregar las muestras de proteínas para correr la electroforesis. IV.-Preparación de las Proteínas. 1. Colocar en cada microtubo de 200 µl (tantos según las muestras que se tengan) 10 l de buffer de muestra. Considerar además la muestra del estándar de proteínas que llevará 10 µl. 2. Agregar el volumen de la proteína equivalente a 50 µg . 3. Hervir en B.M. a 95oC por 5 min. 4. Hacer lo mismocon 8-10 µl del estándar de P.M. con 20 µl de buffer de muestra. 5. Cargar la muestra, con jeringa de 50 µl, y lavarla con agua caliente en cada toma de muestra. V.- Electroforesis 1. Una vez hechos los geles, quitar los peines a cada uno, con mucho cuidado para mantener los carriles de los pozos. 2. Colocar los geles en la cámara de electroforesis y llenar con el Buffer de Corrida en el interior yexterior de los geles. 3. Cargar cada una de las muestras en los carriles del gel, para ello utilizando la jeringa Hamilton, cuidar de lavarla cada que se coloque una nueva muestra. 4. Si quedan carriles sin muestra, agregarles sólo buffer de muestra. 5. Correr la electroforesis a 200 volts durante 60 min. VI.-Transferencia:

María de la Soledad Lagunes Castro

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