Técnicas Selectas De Biología Molecular

Tabla de contenido

Aislamiento de RNAt TRIzol 3
Gel de Agarosa al 1% para RNAt 4
Aislamiento de DNA (fenol-cloroformo) 5
Reacción de RT 6
Reacciones de PCR 7
PCR convencional 7
Reacciones de PCR Mix 7
Reacción de qPCR 8
Clonación 9
Macroarreglos 10
Preparación de sonda 10
Hibridación 10
Detección 11
Revelado 11
Reactivos 13
MOPS 10X 13
Buffer carga para RNAt (Gel de agarosa al1% desnaturalizante) 13
Solución Salina para Camarón SIC-EDTA 13
Tubos libres de Pirogenos 13
Monómero de acrilamida 14
Buffer de Separación 14
APS 10% 14



Aislamiento de RNAt TRIzol

1. Extracción de los Hc con anticoagulante (Tejido), centrifugar cell a 800g por 10 min.

2. Agregar al paquete cell 750 µl de TRIzol a Temp. Ambiente, y homogenizar.

3.Agregar 250 µl de H2O-DEPC (vol final 1ml) e incubar a Temp. Amb 5 min.

4. Agregar 200 µl de cloroformo, agitar suavemente e incubar a Temp. Amb 10 min (LAVADO 1)

5. Centrifugar a 12,000 g a 4°C por 15 min.

6. Recuperar el sobrenadante a otro tubo aprox. 500 µl.

7. Agregar 200 µl de cloroformo, agitar suavemente e incubar a Temp. Amb 10 min (LAVADO 2)8. Centrifugar a 12,000 g a 4°C por 15 min.

9. Recuperar el sobrenadante a otro tubo aprox. 500 µl.

10. Precipitar el RNA con 500 µl de isopropanol e incubar a Temp. Amb 10 min.

11. Centrifugar a 12,000 g a 4°C por 10 min.

12. Descartar el sobrenadante y lavar con 1ml de etanol al 75%(DEPC), aplicar vortex

13. Centrifugar 5 min a 4°C a 7,500g14. Descartar el sobrenadante y secar a Tem. Amb. o en vacufugue pegados ala pared.

15. Re suspender en 100µl H2O-DEPC.

16. Cuantificar 260/280 nm.





Gel de Agarosa al 1% para RNAt

0.3% de Agarosa

3ml de MOPS 10X

25.3ml de H2O-DEPC



Se disuelve con calor y se deja enfriar aprox 50(C se agrega 1.23ml de formaldehído al 37%. Vaciar en la placa30ml para la formación del gel.

Nota: el bromuro de etidio se agrega a la muestra (1(l de 1(g/ml) ya que si se agrega al gel por causa del formaldehído se sobretiñe y las bandas no se alcanzan a observar. También se le adiciona ala muestra 1(l de Buffer carga para RNAt.

Nota: El buffer de corrida es el MPOS 1X que se prepara a partir del MPOS 10X diluyendo con H2O-DEPC.


Aislamiento deDNA (fenol-cloroformo)

1. Extracción de los Hc con SIC-EDTA, centrifugar a 800g por 20 min

2. Se adicionan al paquete cell 500µl de buffer de extracción y homogenizar.

3. Agredar 10 µl de RNAasa (20µg/ml)

4. Incubar 1h a 37°C.

5. Se adicionan 2µl de proteinaza K (2 µg/ml)

6. Incubar por 3h a 55°C, con agitación ocasional

7. Se agregan 500µl de fenol pH 7.3 yhomogenizar, dejar reposar 3 min.

8. Centrifugar a 14,000 rpm por 20 min, y separar el sobre (fase acuosa).

9. Agregar 500µl de cloroformo, homogenisar.

10. Centrifugar a 14,000 rpm por 10 min, y separar el sobre (fase acuosa).

11. Agregar 500µl de fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1) y agitar.

12. Centrifugar durante 20 min a 14,000 rmp, y separar el sobre(fase acuosa).

13. Agregar un volumen de cloroformo y mezclar con vortex (1 o 2 veces)

14. Centrifugar por 5 min a 12,000 rpm y separar el sobre (fase acuosa).

15. Precipitar con 2 vol. de etanol absoluto y (el vol total/10) de NaCl 5M.

16. Incubar a –70°C por toda la noche o 2h.

17. Centrifugar a 14,000 rpm y vaciar a otro tubo.

18. Tirar el sobre, lavar el pp con 1 mlde etanol al 70% agitar suavemente.

19. Centrifugar a 14,000 rpm por 5 min.

20. Tirar el sobre y secar en el SAVAT de 5min a 30°C (Evaporar todo).




Reacción de RT


|Reactivos |1Rx |
|5X First-Strand Buffer |4(l |
|DTT(0.1M) |2(l...