técnico en computación

8. Espectrofometría: Espectros de absorción y
cuantificación colorimétrica de biomoléculas
Nieves Abril Díaz1, J. Antonio Bárcena Ruiz1,
Emilio Fernández Reyes1, Aurora Galván Cejudo1,
Jesús Jorrín Novo1, José Peinado Peinado1,
Fermín Toribio Meléndez-Valdés1, Isaac Túnez Fiñana2
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,
Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa,14071-Córdoba,
2
Facultad de Medicina, Avda. Menéndez Pidal s/n, 14004-Córdoba.

1

RESUMEN

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite
determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en
que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez
que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la
concentración. Para hacereste tipo de medidas se emplea un
espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de
la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por
la misma.
En esta práctica se darán a conocer las características generales y
conceptos relacionados con la espectrofotometría. A continuación y tras
la explicación del funcionamiento del espectrofotómetro seharán
espectros de absorción con el fin de determinar la longitud de onda
donde la muestra presenta la máxima absorción, y tras realizar las
correspondientes
rectas
de
calibrado
se
cuantificarán
las
concentraciones de distintas biomoléculas.
Palabras clave: Absorbancia;
espectro; rectas de calibrado.

transmitancia;

colorimetría;

cromóforo;

Abreviaturas empleadas. A: Absorbancia;4-AP: 4-Aminoantipirina; FMN:
flavin mononucleótido; FMNH2: forma reducida del flavin mononucleótido; I:
intensidad de luz; N-NEDA: N-Naftol-1-etilendiamino; p-NP: p-nitrofenol; POD:
Peroxidasa; T: transmitancia; UV: luz ultravioleta.
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización
de técnicas analíticas que permitan sudeterminación cualitativa y cuantitativa,
así como su caracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos
más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopía, en general, y
la espectroscopía ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y
cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo

1

de reactivos específicos que reaccionan conel compuesto a analizar y forman
un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.
El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas
para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UVvisible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede
absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de laestructura
atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica,
constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso
instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma
de energía interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la
fotosíntesis en plantas ybacterias. Cuando la luz (considerada como energía)
es absorbida por una molécula se origina un salto desde un estado energético
basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energía (estado excitado), E2. Y
sólo se absorberá la energía que permita el salto al estado excitado. Cada
molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del
resto de moléculas. Comoconsecuencia, la absorción que a distintas
longitudes de onda presenta una molécula -esto es, su espectro de absorciónconstituye una seña de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma
excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético fundamental.
Figura 1. Diagrama de niveles de energía en
una molécula. La absorción de energía
luminosa hace que la molécula pase desde un...