Taller técnicas moleculares

CÁTEDRA BIOTECNOLOGÍA PARA NO BIOTECNÓLOGOS

TALLER TÉCNICAS MOLECULARES





ELECTROFORESIS



1. ¿Cuál es el principio de la electroforesis?




variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa,que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que laspequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.




2. ¿Cuáles son las aplicaciones que se le han dado a esta técnica?

La electroforesis en gel se utiliza en biología molecular, genética y bioquímica:
• La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efectúa en geles de agarosa.
• Laelectroforesis de proteínas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), isoelectroenfoque, geles nativos o electroforesis bidimensional.
• Electroforesis capilar.
• Electroforesis de ADN.
• Zimografía o zimogramas
• Extracción en gel.
3. ¿Qué clases de electroforesis se pueden encontrar?



En condiciones desnaturalizantes: se basa en añadir compuestos quealteren las condiciones nativas de las proteínas y que se agrupan en el llamado tampón de carga que se añade antes de cargar las muestras en el gel y después se incuban a unos 100 ºC durante 4 minutos para que tenga su efecto. El tampón de carga consiste en un agente reductor, Me ( mercapto etanol) que se encarga de eliminar los puentes disulfuro. El SDS (dodecil sulfato sódico) es el detergentederivado del ácido de doce carbonos, se une a las proteínas y las desnaturaliza. Esa unión es constante, 1,4 gramos de SDS por gramo de proteína. Además, el detergente está cargado negativamente, y por lo tanto es el que se ocupa de dar carga a las proteínas. En el tampón también se incluye el azul de bromofenol, que se trata de un colorante con carga negativa (por eso se utiliza) y con una movilidadelectroforética que equivaldría a pequeños polipéptidos. Su función es la de ir por delante de las proteínas para ir marcando el frente de electroforesis y que podamos visualizar como se va realizando la corrida (recordemos que tanto el gel como las proteínas son transparentes). El glicerol lo que hace es aumentar la densidad de la muestra, de modo que al echarla en el pocillo no difunda ni se pasea los pocillos de al lado. Con todo esto nos encontramos con todas las proteínas cargadas negativamente, con la relación q/m constante se consigue que las proteínas se separen por su tamaño, no por su carga.
Electroforesis Discontinua: En cualquier técnica de separación, nos encontramos con un problema, que consiste en la base de la separación, y es que dos partículas con diferentescondiciones deben partir del mismo punto y al mismo tiempo para que el proceso no se vea desvirtuado. Enfocando esto a la electroforesis, nos podemos encontrar con un caso donde dos partículas con diferente formen dos bandas solapadas (como se observa en la figura) debido a la altura del pocillo, que es en muchos casos bastante grande en comparación con . El resultado, por tanto, la resolución del gelsería mucho menor y podría estar falseado. Por esta causa se diseñó la electroforesis discontinua, con el fin de minimizar las diferencias de distancia en la salida para que la separación nos permita obtener la mayor resolución.
Electroforesis diagonal: se compone de varias fases, teniendo como objetivo el aislado selectivo de partes de proteínas como los aminoácidos terminales o los implicados...