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Guía de Taller No. 3
Cinética Enzimática
1. Se ha purificado una enzima a partir de hígado de rata. En la purificación se partió de 500 mL de
extracto crudo que contenía 2 g de proteína. 50 µL de ese extracto crudo catalizaban, en
condiciones óptimas de ensayo, la producción de 1 nmol de producto en 1 segundo. Tras varios
pasos de purificación se obtuvieron 2 mL de una preparación de enzimapura que contenía 3 mg
de proteína por mililitro y presentaba una actividad total de 120 U.
a) Calcular la concentración de la enzima en el extracto crudo en U/mL y katales/mL.
b) Determinar la actividad específica, en U/mg de proteína, en el extracto crudo.
c) Calcular la recuperación del proceso de purificación y el número de veces que se ha purificado la
enzima.
Sol.: a) 1,2 U/mL o 0,02µkatales/mL;

b) AE = 0,3 U/mg;

c) R= 20%, FP= 66,7 veces.

2. La descarboxilación enzimática de un ß-cetoácido, ensayada en 1 mL de mezcla de reacción,
procede con las siguientes velocidades iniciales a las concentraciones de sustrato que se citan:
Vo (µmoles CO2/2 min)
0,588
0,500
0,417
0,370
0,252

[cetoácido] (M)
2,500 x 10-3
1,000 x 10-3
0,714 x 10-3
0,526 x 10-3
0,250 x10-3

A partir de estos datos calcular Vmáx y KM de esta reacción enzimática.
Sol.: KM = 0,43 mM; Vmáx = 0,35 µmol/min.

3. La velocidad inicial de una reacción enzimática se determinó a distintas concentraciones de
sustrato. Calcular KM y Vmáx por los distintos métodos gráficos a partir de los datos que se
relacionan a continuación:
[S] (M)
Vo(mmol/l min)
2,3 x 10-3
0,95
3,0 x 10-31,13
4,5 x 10-3
1,42
12,0 x 10-3
2,14
38,0 x 10-3
2,64
Sol.: KM = 5 mM; Vmáx = 3 mmol/l min.

4. Para estimar los parámetros cinéticos de una determinada enzima se realizaron una serie de
ensayos utilizando 20 µL de una preparación de la misma y a distintas concentraciones de su
sustrato. Los valores de Vo obtenidos se recogen en la tabla siguiente:
[S] (µM)
3,15
4,16
8,30
12,50Vo (nmol/ml min)
10,0
12,5
20,0
25,0

Calcular las actividades total y específica de la preparación enzimática, sabiendo que su volumen
total era de 10 mL y su contenido en proteína de 200 µg/mL.
Sol.: AT= 25 U, AE= 12,5 U/mg.

5. Disponemos de una preparación de una enzima de la que queremos conocer sus parámetros
cinéticos.Para ello realizamos varios ensayos en los que cambiamos laconcentración del sustrato y
obtenemos los siguientes resultados:
[S] (mM)
Vo (nmoles mL-1 min -1)
0,33
24,98
0,50
33,33
1,00
50,00
2,00
66,67
¿Cuáles son la KM y la Vmáx de la enzima? Si para los ensayos habíamos utilizado 20 µL de la
preparación enzimática y sabemos que ésta tiene una concentración de proteína de 5 mg/mL,
¿cuál es la actividad específica de dicha preparación? ¿Quévolumen de ella hemos de añadir a 1
mL de mezcla de reacción con [S] = 0,2 M para que se formen 4,5 µmoles de producto en 10 min?
Sol.: KM = 1 mM, Vmáx = 0,1 mM/min., AE = 1 U/mg proteína; 90 µL.

6. La KM de cierta enzima para su sustrato es 75 µM. Cuando se ensaya con una concentración
inicial de sustrato de 50 mM, se observa que al cabo de 15 minutos se ha transformado el 30% de
sustrato.a) Calcular la velocidad máxima de la reacción.
b) Cuando se ensaya la actividad con distintas concentraciones de sustrato, en presencia de un
cierto inhibidor a una concentración de 50 µM, y se representan gráficamente los resultados
mediante la representación de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es la misma que
cuando el experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero laordenada en el origen aumenta
al doble. ¿Qué tipo de inhibición se ha producido? Calcular la Ki.
c) Calcular el grado de inhibición cuando el ensayo se hace con una concentración de sustrato de
150 µM, en presencia de 100 µM del inhibidor anterior.

Sol.: a) 1 mM min-1; b) Incompetitiva; Ki = 50 µM; c) i = 0,57.

7. Una reacción enzimática se lleva a cabo, a distintas [S], en ausencia y...