Tax

TAXONOMÍA MOLECULAR
MOLECULAR
TAXONOMÍA
Microbiología General
Área Micología

Dra. Alicia Luque
CEREMIC

Taxonomía clásica
Carecen de reproducibilidad: los caracteres fenotípicos
pueden variar con las condiciones ambientales.
PLEOMORFISMO

Debido al bajo poder discriminatorio y a la frecuente
incongruencia de los datos morfológicos y fisiológicos el
sistema diagnóstico se hace bastantecomplicado.

Taxonomía molecular
Se han desarrollado un gran número de técnicas
moleculares para la identificación de hongos
filamentosos y levaduras debido a:
Rapidez y grado de simplicidad de las habilidades
requeridas.
Sensibilidad.
Reproductibilidad.

Taxonomía molecular
Los sistema de clasificación de levaduras y hongos
filamentosos, en la actualidad se basan en establecer las
diferencias existentesentre algunas de las moléculas de
estos organismos:
composición de la pared celular (HPLC, cromatografía de
intercambio iónico)
clasificación de quinonas de la cadena de transporte
electrónico (cromatografía, HPLC, espectroscopia)
comparación de patrones electroforéticos de enzimas
varios métodos basados en la comparación del DNA.

Taxonomía molecular
•Caracterización de ácidos nucleicos.
Elestudio del DNA de los hongos se complica por el hecho de que
estas poseen un genoma complejo, consistente en DNA nuclear
(nDNA), DNA mitocondrial (mtDNA) y en algunos casos DNA
plasmídico.
Hibridación DNA/DNA
porcentaje G+C
Métodos actuales son:
restricción del ADN mitocondrial
polimorfismos de ADN generados aleatoriamente por PCR
(RAPD-PCR)
electroforesis de campo pulsante
amplificación yrestricción del DNA ribosomal
secuenciación de genes nucleares y mitocondriales

RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL
Características del ADN mitocondrial
Estructura del ADN mitocondrial: la pobreza en genes del mtDNA está
compensada por la gran complejidad estructural de algunas regiones
intergénicas y también por la presencia de intrones (contribuyen en gran
manera a incrementar las diferencias inter- eintraespecíficas existentes en los
genomas mitocondriales )

Restricción del ADN mitocondrial
Digestión del mtDNA con endonucleasas
de restricción, que nos permitan
generar polimorfismos en el tamaño de
los fragmentos (RFLP).

RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL
Análisis de los resultados

RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL
Ventajas y desventajas de la técnica.
Ventajas:
1.- Repetitiva en cualquiercircunstancia. El patrón de restricción
no cambia a menos que cambie la secuencia del mtDNA que
reconoce el enzima de restricción.
2.- Diferentes niveles de discriminación dependiendo del
género que estemos estudiando. Es una ventaja cuando
tenemos gran variabilidad entre cepas de la misma especie y
queremos discriminar entre ellas (patrón de cepa). A veces no se
puede distinguir entre cepas de lamisma especie, entonces nos
sirve para identificar nuevos aislados de esa especie (patrón de
especie).
Desventajas:
1.- Se necesita DNA de gran calidad, libre de restos celulares,
proteínas y RNA. Requiere un proceso de extracción de DNA, el
cual puede no ser necesario utilizando otras técnicas de
tipificación molecular.
2.- Diferentes niveles de discriminación dependiendo del
género que estemosestudiando.

POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR
AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR)
Utilizando un único cebador de secuencia arbitraria y corta
(normalmente de 10-12 pb) y una baja temperatura de hibridación,
que produce polimorfismo entre los patrones del DNA amplificado.

POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR
AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR)
Ventajas
1.- La mayor ventaja esque no necesitamos ninguna información previa del
organismo de que se trata, ya que sirve para cualquier organismo. Tampoco
necesitamos conocer la secuencia del DNA que vamos a amplificar.
2.- Es una técnica muy sencilla y rápida.
3.- Requiere cantidades muy pequeñas de DNA, y tampoco es necesario
que la calidad del DNA sea muy buena, aunque esto último afecta a la
reproducibilidad.
4.- Es un...