Tecnicas Basicas De Microbiologia

Reduca (Biología). Serie Microbiología. 3 (5): 15-38, 2010
ISSN: 1989-3620

Técnicas básicas de Microbiología Observación de bacterias
Covadonga Vázquez. Ana Martín. Mª Isabel de Silóniz. Susana Serrano.
Departamento de Microbiología III. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense. C/José Antonio Novais, 2. 28040 Madrid. covi@bio.ucm.es anamarti@bio.ucm.es siloniz@bio.ucm.essuserra@bio.ucm.es

Resumen: La observación de bacterias con microscopía óptica, en un laboratorio de Microbiología, puede realizarse por diferentes procedimientos como son la observación directa de microorganismos “in vivo” o el tratamiento con colorantes mediante tinción positiva y negativa, procesos dirigidos a incrementar el contraste y por consiguiente a optimizar el resultado. Se describenaquí los métodos y las técnicas más habituales para la observación de muestras con microscopía óptica, así como procedimientos de observación con microscopía de fluorescencia y confocal con diferentes tipos de fluorocromos y sondas moleculares. Palabras clave: Microscopía de campo claro y fluorescencia. Microscopía confocal. Tinciones. Frotis. Fijación. Colorantes. Fluorocromos. Sondas moleculares.INTRODUCCIÓN

Los microorganismos, concretamente las bacterias, pueden observarse directamente al microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células y su entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para la observación de la movilidad bacteriana. Los microscopios de contraste de fases, interferencia diferencial (DIC ola microscopía de Nomarski) y campo oscuro permiten aumentar el contraste, empleándose para la observación de vainas, filamentos u otras estructuras bacterianas. La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentarnotablemente el contraste. En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con

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ISSN: 1989-3620

diferentes tratamientos: fijaciónpor calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol,folmaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares. Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente, en ella un colorante se une a ciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados en microbiología tienen en común la presencia de grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son losresponsables del color mediante la unión a estructuras celulares por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los colorantes que se unen por enlaces covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de DNA, donde el colorante se une a la desoxi-ribosa. Por otra parte, en la tinción negativa se utilizan compuestosque no penetran en las células sino que impregnan el medio circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.

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