Tecnicas Citogeneticas
Páginas: 10 (2319 palabras)
Publicado: 15 de octubre de 2012
TECNICAS DE EVALUACION DE
SUSTANCIAS DE EFECTO GENOTOXICO
EN CELULAS DE MAMIFERO
Dulout, F; Grillo, C JC y Seoane, A
Centro de Investigaciones
en Genética Básica y Aplicada (CIGEBA)
Facultad de Ciencias Veterinarias
Universidad Nacional de La Plata
2002
TECNICAS DE EVALUACION DE
SUSTANCIAS DE EFECTO GENOTOXICO
EN CELULAS DE MAMIFERO
Dulout, F; De Luca,JC y Seoane, A
Centro de Investigaciones
en Genética Básica y Aplicada (CIGEBA)
Facultad de Ciencias Veterinarias
Universidad Nacional de La Plata
2000
A) Cultivo de linfocitos humanos para el estudio de Aberraciones Cromosómicas Estructurales (ACE)
La sangre total heparinizada se cultiva en suspensión en frascos de vidrio. Se utiliza medio de cultivo Ham F10 (GIBCO)suplementado con 10 % de suero bovino fetal, antibióticos (penicilina 60 UI y estreptomicina 50 g/ml).
a) Las células se incuban durante 53-54 horas a 37 ºC, período en el que alcanzan la primera división mitótica luego de la estimulación por fitohemaglutinina.
b) Dos horas y media antes de finalizar el tiempo de incubación se adiciona colchicina a cada frasco (dosis final 1,0 g/ml).
c) Lasuspensión celular se centrifuga a 250 g durante 8 minutos.
d) Se descarta el sobrenadante y se agrega 5 ml de solución hipotónica (KCl 0,075M) dejando los tubos a 37 ºC durante 20 minutos.
e) Se centrifuga a 250 g durante 8-10 minutos.
f) Se elimina el sobrenadante y se agrega 5 ml de fijador formado por tres partes de alcohol metílico y una parte de ácido acético glacial.
g) Se realizan varioscambios de fijador previa centrifugación y eliminación del sobrenadante.
h) Terminada la fijación, el material precipitado cubierto con fijador se guarda en heladera a 4 ºC por 24 horas.
i) Los preparados se realizan por goteo y secado al aire. Posteriormente se colorean con Giemsa al 5 % durante 7-8 minutos.
j) Una vez secos se protegen con cubreobjetos montados con DePex. Se analizan enmicroscopio óptico.
B) Cultivo de linfocitos humanos para el estudio de Intercambios de Cromátidas Hermanas (ICH)
La sangre total heparinizada se cultiva de la misma manera descripta en A). Las células se incuban en completa oscuridad durante 72 horas previo agregado de 10 g/ml de 5-Bromo-2-desoxiuridina (BrdU). En este tiempo de cultivo los linfocitos alcanzan la segunda mitosis.
Los preparadosse tratan siguiendo la técnica de Perry y Wolff (1974) para ICH:
a) Los preparados se sumergen en una solución constituída por 0,1 mg/ml del fluorocromo Höechst 33258 en buffer fosfato 0,1 M y pH 6,8 durante 20 minutos.
b) Los portaobjetos se montan con buffer fosfato 0,1 M y pH 6,8 y se exponen una hora a la luz fluorescente. De esta manera se acelera la fotólisis de las regiones de lamolécula de ADN sustituída por BrdU, análogo de la timidina.
c) Transcurrido el tiempo indicado se lavan los preparados con agua destilada hasta la eliminación del cubreobjetos. Se secan al aire.
d) Las preparaciones son predigeridas durante 5 minutos con fosfato disódico 1 M y pH 8 a 88 ºC.
e) Se lavan con agua destilada y se secan al aire.
f) Posteriormente se colorean con Giemsa al 5 % durante7-8 minutos quedando la cromátida bisustituida coloreada con menor intensidad que la cromátida monosustituída.
g) Una vez secos se montan con DePex y se observan en microscopio óptico.
C) Cultivo de células CHO para el esudio de Aberraciones Cromosómicas Estructurales (ACE)
Las células CHO se cultivan en monocapa en frascos Falcon utilizando un medio de cultivo Ham F10 suplementadocon 10% de suero bovino fetal y antibióticos (penicilina 60 UI y estreptomicina 50 g/ml).
a) Utilizando frascos Falcon T-25, se siembran 100.000 células/ml en 10 ml de medio de cultivo.
b) Dos horas y media antes de finalizar el período de incubación se adicionan 100 l de colchicina (2,5 x 10-6 M) a cada frasco (concentración final 1,0 g/ml).
c) Cumplido el tiempo de incubación se vuelca...
SUSTANCIAS DE EFECTO GENOTOXICO
EN CELULAS DE MAMIFERO
Dulout, F; Grillo, C JC y Seoane, A
Centro de Investigaciones
en Genética Básica y Aplicada (CIGEBA)
Facultad de Ciencias Veterinarias
Universidad Nacional de La Plata
2002
TECNICAS DE EVALUACION DE
SUSTANCIAS DE EFECTO GENOTOXICO
EN CELULAS DE MAMIFERO
Dulout, F; De Luca,JC y Seoane, A
Centro de Investigaciones
en Genética Básica y Aplicada (CIGEBA)
Facultad de Ciencias Veterinarias
Universidad Nacional de La Plata
2000
A) Cultivo de linfocitos humanos para el estudio de Aberraciones Cromosómicas Estructurales (ACE)
La sangre total heparinizada se cultiva en suspensión en frascos de vidrio. Se utiliza medio de cultivo Ham F10 (GIBCO)suplementado con 10 % de suero bovino fetal, antibióticos (penicilina 60 UI y estreptomicina 50 g/ml).
a) Las células se incuban durante 53-54 horas a 37 ºC, período en el que alcanzan la primera división mitótica luego de la estimulación por fitohemaglutinina.
b) Dos horas y media antes de finalizar el tiempo de incubación se adiciona colchicina a cada frasco (dosis final 1,0 g/ml).
c) Lasuspensión celular se centrifuga a 250 g durante 8 minutos.
d) Se descarta el sobrenadante y se agrega 5 ml de solución hipotónica (KCl 0,075M) dejando los tubos a 37 ºC durante 20 minutos.
e) Se centrifuga a 250 g durante 8-10 minutos.
f) Se elimina el sobrenadante y se agrega 5 ml de fijador formado por tres partes de alcohol metílico y una parte de ácido acético glacial.
g) Se realizan varioscambios de fijador previa centrifugación y eliminación del sobrenadante.
h) Terminada la fijación, el material precipitado cubierto con fijador se guarda en heladera a 4 ºC por 24 horas.
i) Los preparados se realizan por goteo y secado al aire. Posteriormente se colorean con Giemsa al 5 % durante 7-8 minutos.
j) Una vez secos se protegen con cubreobjetos montados con DePex. Se analizan enmicroscopio óptico.
B) Cultivo de linfocitos humanos para el estudio de Intercambios de Cromátidas Hermanas (ICH)
La sangre total heparinizada se cultiva de la misma manera descripta en A). Las células se incuban en completa oscuridad durante 72 horas previo agregado de 10 g/ml de 5-Bromo-2-desoxiuridina (BrdU). En este tiempo de cultivo los linfocitos alcanzan la segunda mitosis.
Los preparadosse tratan siguiendo la técnica de Perry y Wolff (1974) para ICH:
a) Los preparados se sumergen en una solución constituída por 0,1 mg/ml del fluorocromo Höechst 33258 en buffer fosfato 0,1 M y pH 6,8 durante 20 minutos.
b) Los portaobjetos se montan con buffer fosfato 0,1 M y pH 6,8 y se exponen una hora a la luz fluorescente. De esta manera se acelera la fotólisis de las regiones de lamolécula de ADN sustituída por BrdU, análogo de la timidina.
c) Transcurrido el tiempo indicado se lavan los preparados con agua destilada hasta la eliminación del cubreobjetos. Se secan al aire.
d) Las preparaciones son predigeridas durante 5 minutos con fosfato disódico 1 M y pH 8 a 88 ºC.
e) Se lavan con agua destilada y se secan al aire.
f) Posteriormente se colorean con Giemsa al 5 % durante7-8 minutos quedando la cromátida bisustituida coloreada con menor intensidad que la cromátida monosustituída.
g) Una vez secos se montan con DePex y se observan en microscopio óptico.
C) Cultivo de células CHO para el esudio de Aberraciones Cromosómicas Estructurales (ACE)
Las células CHO se cultivan en monocapa en frascos Falcon utilizando un medio de cultivo Ham F10 suplementadocon 10% de suero bovino fetal y antibióticos (penicilina 60 UI y estreptomicina 50 g/ml).
a) Utilizando frascos Falcon T-25, se siembran 100.000 células/ml en 10 ml de medio de cultivo.
b) Dos horas y media antes de finalizar el período de incubación se adicionan 100 l de colchicina (2,5 x 10-6 M) a cada frasco (concentración final 1,0 g/ml).
c) Cumplido el tiempo de incubación se vuelca...
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