TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Western Blot
Southern Blot

Patch Clamp
Whole Cell ó Patch Clamp

Detección:

HPLC



Ópticas: Microscopio con focal
Microscopio electrónico

Animales: Animales transgénicos
Animales Nockout

Southern Blot (inmunotransferencia Southern). La primera técnica de inmunotransferencia que se diseñó se conoce comoSouthern Blot en honor a su creador E.M. Southern. Con esta técnica se puede detectar un único fragmento de restricción específico en una mezcla muy compleja de fragmentos producidos por la escisión de todo el genoma humano con una enzima de restricción. En esta mezcla tan compleja, muchos fragmentos tendrán la misma o casi la misma longitud y por lo tanto migrarán juntos durante la electroforesis.Aunque no todos los fragmentos se separan por completo mediante electroforesis en gel, para lograrlo, los fragmentos de restricción presentes en el gel son desnaturalizados con álcali y transferidos a un filtro de nitrocelulosa o membrana de nailon por inmunotransferencia. Este procedimiento preserva la distribución de los fragmentos en el gel y crea una réplica de este sobre el filtro, muy similaral filtro de la réplica producida a partir de clones en una genoteca.
Luego se incuba el filtro en condiciones de hibridación con una sonda de DNA especifica marcada radiactivamente, generada casi siempre a partir de un fragmento de restricción clonado.
Sirve para detectar por HIBRIDACION la presencia de una porción de ADN en una muestra.

Southern Blot: La técnica consiste en cortar el DNAcon enzimas de restricción para producir fragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por su tamaño molecular mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Los fragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumerge en una solución salina para desnaturarlo a hebras sencillas. Las hebrasse adhieren al papel secante que las recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentos se fijan (por UV) al filtro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tenga una secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava el filtro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediantefluorescencia (en caso de marcaje no-radioctivo).
El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas específicas.
Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo utilizando sonicación o enzimas de restricción.
Los fragmentosobtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.
A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico,DNAds ó RNAm, que reconocerá a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos.
El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.
Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blotderiva en parte del apellido Southern del investigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.

Técnica de hibridación de Southern
La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de la técnica de transferencia e hibridación de Southern para analizar regiones polimórficas del ADN humano.

Western Blot. Es uno de...