Tecnicas De Electroforesis
Páginas: 17 (4016 palabras)
Publicado: 2 de mayo de 2012
Práctica No. 5
ELECTROFORESIS EN SDS-PAGE
(por: Lic. Nereida Rojas y Dra. Trina Perrone)
INTRODUCCIÓN
La técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de Sodio Dodecil Sulfato bajo condiciones reductoras (SDS-PAGE) es un método rápido, reproducible y de bajo costo ampliamente utilizado para cuantificar, comparar y caracterizar proteínas. Se trata de una técnicaanalítica- semipreparativa en el que se separan biomoléculas según su peso molecular bajo la acción de un campo eléctrico y se obtienen moléculas para estudios inmunológicos. (Laemmli 1.970).
El método permite separar proteínas haciéndolas pasar por una resina: Bis-Acrilamida, la cual es un agente entrecruzador que genera un polímero sobre el cual se adherirán las proteínas.
Laseparación electroforética se realiza en condiciones desnaturalizantes, al añadir compuestos que alteren las condiciones nativas de las proteínas y que se agrupan en una solución denominada: tampón de carga. El tampón de carga consiste en un agente reductor, Me ( mercapto-etanol) que se encarga de eliminar los puentes disulfuro que se forman en la estructura terciaria de las proteinas entre los aminoácidosCisteína. El SDS (dodecil sulfato sódico) es el detergente derivado del ácido de doce carbonos, se une a las proteínas y las desnaturaliza y ya que está cargado negativamente, le aporta carga a las proteínas.
En el tampón también se incluye el azul de bromofenol, colorante con carga negativa y con una movilidad electroforética que equivaldría a pequeños polipéptidos. Su función es la de irpor delante de las proteínas para ir marcando el frente de electroforesis y que podamos visualizar como se va realizando la corrida.
Al aplicar un campo eléctrico a la muestra inmersa en el tampón de carga, el complejo proteína-SDS migrará hacia el polo positivo y se separará según su tamaño ya que se produce pérdida de la estructura terciaria y secundaria de las proteínas, generándose tantascadenas polipeptídicas como posea la proteína.
Los polipéptidos de menor peso molecular, migrarán más rápido, mientras que aquellos de alto peso lo harán más lentamente.
Las proteínas separadas en el gel de Bis- Acrilamida pueden ser visualizadas a través de métodos de tinción, utilizando moléculas afines a las proteínas, tal como el azul de Coomassie, diluido en una solución apropiada.Las aplicaciones más comunes de esta técnica son:
* Análisis del grado de pureza de una proteína.
* Determinación de su peso molecular.
* Verificación de la concentración de proteínas.
* Detección de proteólisis.
* Identificación de proteínas inmunoprecipitadas.
* Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos.
Fundamento Bioquímico
Como se mencionóen la introducción anterior, uno de los medios de soporte más utilizados para la separación de proteínas es el gel de poliacrilamida. Cuya realización requiere partir de cuatro componentes líquidos:
Acrilamida | CH2=CHCONH2 |
Agente entrecruzante: bisacrilamida | CH2=CHCONH 2 CH 2 CONH 2CH=CH 2 |
TEMED (Tetrametilen, etilen diamina) | (CH 3) 2CHNHCH(CH 3) 2 |
APS (Persulfato amónico) | S 2O8(NH 4) 2 |
Estos componentes reaccionan de la siguiente forma:
APS
Acrilamida
Polímero entrecruzador
Objetivos:
* Familiarizar al estudiante con la técnica de electroforesis en SDS-PAGE y sus potenciales aplicaciones en el campo de los hemoparásitos.
* Someter a electroforesis en SDS-PAGE, a extractos protéicos de parásitos (Trypanosoma evansi).MATERIALES
A.-Equipos
* Se utilizará como modelo para la práctica el equipo Mini-Protean de la casa comercial Bio-Rad® ( Ver figura abajo). El protocolo utilizado puede ser fácilmente adaptable a otros sistemas. La ventaja de utilizar este aparato es que se trabaja con un sistema de mini geles que requiere poco material, la corrida es más rápida y se mantiene una alta resolución en la separación...
ELECTROFORESIS EN SDS-PAGE
(por: Lic. Nereida Rojas y Dra. Trina Perrone)
INTRODUCCIÓN
La técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de Sodio Dodecil Sulfato bajo condiciones reductoras (SDS-PAGE) es un método rápido, reproducible y de bajo costo ampliamente utilizado para cuantificar, comparar y caracterizar proteínas. Se trata de una técnicaanalítica- semipreparativa en el que se separan biomoléculas según su peso molecular bajo la acción de un campo eléctrico y se obtienen moléculas para estudios inmunológicos. (Laemmli 1.970).
El método permite separar proteínas haciéndolas pasar por una resina: Bis-Acrilamida, la cual es un agente entrecruzador que genera un polímero sobre el cual se adherirán las proteínas.
Laseparación electroforética se realiza en condiciones desnaturalizantes, al añadir compuestos que alteren las condiciones nativas de las proteínas y que se agrupan en una solución denominada: tampón de carga. El tampón de carga consiste en un agente reductor, Me ( mercapto-etanol) que se encarga de eliminar los puentes disulfuro que se forman en la estructura terciaria de las proteinas entre los aminoácidosCisteína. El SDS (dodecil sulfato sódico) es el detergente derivado del ácido de doce carbonos, se une a las proteínas y las desnaturaliza y ya que está cargado negativamente, le aporta carga a las proteínas.
En el tampón también se incluye el azul de bromofenol, colorante con carga negativa y con una movilidad electroforética que equivaldría a pequeños polipéptidos. Su función es la de irpor delante de las proteínas para ir marcando el frente de electroforesis y que podamos visualizar como se va realizando la corrida.
Al aplicar un campo eléctrico a la muestra inmersa en el tampón de carga, el complejo proteína-SDS migrará hacia el polo positivo y se separará según su tamaño ya que se produce pérdida de la estructura terciaria y secundaria de las proteínas, generándose tantascadenas polipeptídicas como posea la proteína.
Los polipéptidos de menor peso molecular, migrarán más rápido, mientras que aquellos de alto peso lo harán más lentamente.
Las proteínas separadas en el gel de Bis- Acrilamida pueden ser visualizadas a través de métodos de tinción, utilizando moléculas afines a las proteínas, tal como el azul de Coomassie, diluido en una solución apropiada.Las aplicaciones más comunes de esta técnica son:
* Análisis del grado de pureza de una proteína.
* Determinación de su peso molecular.
* Verificación de la concentración de proteínas.
* Detección de proteólisis.
* Identificación de proteínas inmunoprecipitadas.
* Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos.
Fundamento Bioquímico
Como se mencionóen la introducción anterior, uno de los medios de soporte más utilizados para la separación de proteínas es el gel de poliacrilamida. Cuya realización requiere partir de cuatro componentes líquidos:
Acrilamida | CH2=CHCONH2 |
Agente entrecruzante: bisacrilamida | CH2=CHCONH 2 CH 2 CONH 2CH=CH 2 |
TEMED (Tetrametilen, etilen diamina) | (CH 3) 2CHNHCH(CH 3) 2 |
APS (Persulfato amónico) | S 2O8(NH 4) 2 |
Estos componentes reaccionan de la siguiente forma:
APS
Acrilamida
Polímero entrecruzador
Objetivos:
* Familiarizar al estudiante con la técnica de electroforesis en SDS-PAGE y sus potenciales aplicaciones en el campo de los hemoparásitos.
* Someter a electroforesis en SDS-PAGE, a extractos protéicos de parásitos (Trypanosoma evansi).MATERIALES
A.-Equipos
* Se utilizará como modelo para la práctica el equipo Mini-Protean de la casa comercial Bio-Rad® ( Ver figura abajo). El protocolo utilizado puede ser fácilmente adaptable a otros sistemas. La ventaja de utilizar este aparato es que se trabaja con un sistema de mini geles que requiere poco material, la corrida es más rápida y se mantiene una alta resolución en la separación...
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