Tecnicas De Lisis Bacteriana
Páginas: 6 (1430 palabras)
Publicado: 23 de enero de 2013
Técnicas Lisis Bacteriana y Obtención de Proteínas
Mauricio Rivera Jaramillo
Enero 2013
Lisis Bacteriana
Existen diversos métodos de Lisis de Bacterias, pero aquí trataremos algunos de los que tengan como objetivo la obtención de proteínas.
Para obtener proteínas intracelulares de los microorganismos existen tres métodos generales; enzimáticos, químicos o físicos. Quizás el ejemplo masdestacado es la Sonicación, que es el método más empleado en la obtención de proteínas en el laboratorio.
Independientemente del esquema de purificación elegido, es esencial tener presente que la mayoría de las proteínas son moléculas excesivamente frágiles. La exposición aún a temperaturas moderadas (ejemplo, 37°C) causa desnaturalización, por lo tanto, todos los pasos deben realizarse abajas temperaturas (0-4°C). Las proteínas son también sensibles a pHs extremos por lo que todos los pasos de purificación se realizan en soluciones buffer y se evitan los pHs extremos.
Métodos Enzimáticos
La Lisozima cataliza de forma específica, la hidrólisis de enlaces β- 1,4-glucosidícos presentes en los mucopéptidos de las paredes celulares de las bacterias. Las bacteriasgram-positivas son las que presentar mayor sensibilidad a la lisozima. Sin embargo, la ruptura final de la envoltura celular, depende a menudo de la presión osmótica del medio de suspensión una vez que se ha digerido la pared. En las bacterias gram-negativas, la ruptura de la pared celular se consigue con lisozima y la adición de EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid), que actúa como agente quelante deiones metálicos, origina generalmente la lisis celular. Esta técnica no se puede utilizar para extracciones a gran escala de enzimas bacterianas debido al costo relativamente alto de la lisozima. En situaciones concretas se ha empleado glucanasas microbianas para hidrolizar las paredes de las levaduras, que contienen β-1,3 glucano y la lisoestafina, empleada para liberar proteínas de estafilococospor ejemplo, la proteína A de S. aureus.
Métodos Químicos
Álcali.
Este método ha sido utilizado con considerable éxito para la extracción de proteínas bacterianas a pequeña y gran escala. Por ejemplo la enzima terapéutica L-asparaginasa puede extraerse de la bacteria Erwinia chrysanthemi, por tratamiento a un pH alcalino entre 11.0 y 12.5, durante 20 minutos. El éxito del tratamientodepende de la estabilidad en álcali del producto a obtener. El elevado pH puede inactivar las proteasas y este método también es valioso en la inactivación de lisis de microorganismos manipulados por ingeniería genética.
Detergentes.
Los detergentes, tanto iónicos, como es el caso del lauril sulfato sódico, colato sódico(aniónico) y el bromuro de cetiltrimetilamonio (catiónico), o no-iónicos, porejemplo el tritón X-100, X-450 o incluso el Tween, se han utilizado para favorecer la lisis celular. Los detergentes iónicos son más reactivos que los detergentes no-iónicos y pueden ocasionar la desnaturalización de muchas proteínas.
La presencia de detergentes puede afectar también a las etapas posteriores de purificación, en particular a la precipitación proteica por tratamiento con sales.Esto puede superarse en muchos casos con el uso de cromatografía de intercambio iónico, por ultra-filtración el tritón X-100 ha sido empleado para la liberación a gran escala del colesteroloxidasa, a partir de Nocardia sp y el colato sódico se ha utilizado para solubilizar pululanasa, una enzima ligada a membrana, a partir de células intactas de Kleipsella pneumoniae.
Se debe tener particularcuidado en el diseño y control de los procesos, debido a los efectos medio ambientales en los que se puede incurrir.
Métodos Físicos
Choque Osmótico.
El choque osmótico ha sido utilizado en la extracción de enzimas hidrolíticas y proteínas ligadas del espacio periplásmico de cierto número de bacterias gram-negativas, incluyendo a Salmonella typhimurium y E. coli.
El método implica el...
Mauricio Rivera Jaramillo
Enero 2013
Lisis Bacteriana
Existen diversos métodos de Lisis de Bacterias, pero aquí trataremos algunos de los que tengan como objetivo la obtención de proteínas.
Para obtener proteínas intracelulares de los microorganismos existen tres métodos generales; enzimáticos, químicos o físicos. Quizás el ejemplo masdestacado es la Sonicación, que es el método más empleado en la obtención de proteínas en el laboratorio.
Independientemente del esquema de purificación elegido, es esencial tener presente que la mayoría de las proteínas son moléculas excesivamente frágiles. La exposición aún a temperaturas moderadas (ejemplo, 37°C) causa desnaturalización, por lo tanto, todos los pasos deben realizarse abajas temperaturas (0-4°C). Las proteínas son también sensibles a pHs extremos por lo que todos los pasos de purificación se realizan en soluciones buffer y se evitan los pHs extremos.
Métodos Enzimáticos
La Lisozima cataliza de forma específica, la hidrólisis de enlaces β- 1,4-glucosidícos presentes en los mucopéptidos de las paredes celulares de las bacterias. Las bacteriasgram-positivas son las que presentar mayor sensibilidad a la lisozima. Sin embargo, la ruptura final de la envoltura celular, depende a menudo de la presión osmótica del medio de suspensión una vez que se ha digerido la pared. En las bacterias gram-negativas, la ruptura de la pared celular se consigue con lisozima y la adición de EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid), que actúa como agente quelante deiones metálicos, origina generalmente la lisis celular. Esta técnica no se puede utilizar para extracciones a gran escala de enzimas bacterianas debido al costo relativamente alto de la lisozima. En situaciones concretas se ha empleado glucanasas microbianas para hidrolizar las paredes de las levaduras, que contienen β-1,3 glucano y la lisoestafina, empleada para liberar proteínas de estafilococospor ejemplo, la proteína A de S. aureus.
Métodos Químicos
Álcali.
Este método ha sido utilizado con considerable éxito para la extracción de proteínas bacterianas a pequeña y gran escala. Por ejemplo la enzima terapéutica L-asparaginasa puede extraerse de la bacteria Erwinia chrysanthemi, por tratamiento a un pH alcalino entre 11.0 y 12.5, durante 20 minutos. El éxito del tratamientodepende de la estabilidad en álcali del producto a obtener. El elevado pH puede inactivar las proteasas y este método también es valioso en la inactivación de lisis de microorganismos manipulados por ingeniería genética.
Detergentes.
Los detergentes, tanto iónicos, como es el caso del lauril sulfato sódico, colato sódico(aniónico) y el bromuro de cetiltrimetilamonio (catiónico), o no-iónicos, porejemplo el tritón X-100, X-450 o incluso el Tween, se han utilizado para favorecer la lisis celular. Los detergentes iónicos son más reactivos que los detergentes no-iónicos y pueden ocasionar la desnaturalización de muchas proteínas.
La presencia de detergentes puede afectar también a las etapas posteriores de purificación, en particular a la precipitación proteica por tratamiento con sales.Esto puede superarse en muchos casos con el uso de cromatografía de intercambio iónico, por ultra-filtración el tritón X-100 ha sido empleado para la liberación a gran escala del colesteroloxidasa, a partir de Nocardia sp y el colato sódico se ha utilizado para solubilizar pululanasa, una enzima ligada a membrana, a partir de células intactas de Kleipsella pneumoniae.
Se debe tener particularcuidado en el diseño y control de los procesos, debido a los efectos medio ambientales en los que se puede incurrir.
Métodos Físicos
Choque Osmótico.
El choque osmótico ha sido utilizado en la extracción de enzimas hidrolíticas y proteínas ligadas del espacio periplásmico de cierto número de bacterias gram-negativas, incluyendo a Salmonella typhimurium y E. coli.
El método implica el...
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