tecnicas de separación proteica

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
Y CUANTIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS
Laura Rincón de Pablo
F.E.A de Análisis Clínicos
Hospital General de Ciudad Real

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
PROTEÍNICAS
o Electroforesis: Cuando una mezcla de moléculas ionizadas son
colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de
atracción hacia el polo que posee carga opuesta, así, las moléculas
cargadaspositivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo
negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el
ánodo (el polo positivo).
o Fue empleado por primera vez por A.Tiselius en 1937.
o El movimiento de las moléculas esta gobernado también por dos
fuerzas adicionales: la fricción con el solvente dificultará  este
movimiento originando una fuerza que se opone y por otro lado  lasmoléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento
browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado 
difusión.
o La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por
ello a mayor temperatura mayor difusión.

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
PROTEÍNICAS
•La suma de todas estas fuerzas provoca que
las moléculas no migren de una manera
homogénea, sino quecomenzaran a moverse
formando un frente cuya anchura aumentara
con el tiempo.
•Para reducir la anchura de este frente
podemos reducir el movimiento de las
moléculas. Una forma común de hacer esto es
formar un gel.
•El gel consiste de un polímero soluble de
muy alto peso molecular que atrapa moléculas
de agua y forma un tamiz  que dificulta el
movimiento
de
los
solutos,
consecuentemente,la migración de las
moléculas será mas lenta, pero el
ensanchamiento del frente se vera reducido.

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PROTEÍNICAS
o Esta separación se basa en la diferente velocidad de
migración de partículas con carga diferente dentro de un
campo eléctrico.
V= µ.E
o La movilidad electroforética de una partícula dependerá de
su carga, de su masa, del medio en el que tiene lugar laseparación y del campo eléctrico.
µ=

Q
6Πηr

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PROTEÍNICAS
Parámetros que afectan a la µ :
1.

Externos :
o
o

1.

Campo E
Temperatura : -Aumento de la Tª

µ=

descenso η

6Πηr

aumento µ

Solvente :
o
o
o
o

1.

Q

Constante dieléctrica (ε): Aumento ε
aumento µ
Viscosidad (η): Descenso η
aumento µ (por disminuir la resistencia porfricción).
Fuerza iónica (FI): Aumento FI
descenso µ (intensidad de carga
alrededor del ion central).
pH: Da el grado de ionización de la partícula.

Sustancia problema :
o
o

Carga de la partícula: Influenciado por el solvente (por el pH).
Forma y tamaño: aumento de tamaño, disminución de movilidad.

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PROTEÍNICAS
o En el laboratorio clínico, la aplicación masimportante de la
electroforesis consiste en separar las proteínas presentes en el suero,
orina y otros fluidos biológicos (LCR, líquido sinovial..).
o La carga de las proteínas, por su naturaleza anfolítica, depende del pH
del medio:
o Cuando en un campo eléctrico el pH del medio es igual al punto isoeléctrico (PI)
de la proteína, no hay migración.
o Para valores de pH por debajo del PI,predominan las cargas positivas y las
proteínas migran hacia el cátodo (-).
o Para valores de pH superiores al PI, las proteínas están cargadas negativamente
y migra hacia el ánodo (+).

La mayoría de las
proteínas intracelulares
tienen carga negativa,
ya
que
su
pH
isoeléctrico es menor
que el pH fisiológico
(prox 7)

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PROTEÍNICAS
o

TIPOS DEELECTROFORESIS:

1.

Electroforesis de frente móvil o libre

2.

Electroforesis de zona: (convencional)
o En papel
o En acetato de celulosa
o En gel (agarosa, poliacrilamida y almidón)

1.

Electroforesis capilar

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PROTEÍNICAS
1.

Electroforesis de frente móvil o libre :
El campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones.
Históricamente, es el origen de...