Tecnicas moleculares

1.

A). QUE MEDIO UTILIZARÍA PARA HACERLO

La técnica básica de extracción y purificación de ADN involucra los siguientes pasos:

1. Lisis celular: en este se busca dañar las membranas externas de la célula para provocar una lisis y que todo el material genético sea liberado al medio.
2. Extracción del ADN: al liberar el ADN de la célula, es necesario separarlo de las múltiples proteínasque están íntimamente relacionadas con él y permitir que los ácidos nucleicos permanezcan en una solución acuosa.
3. Concentración: al tener el ADN en una solución acuosa, es importante concentrarlo en un volumen pequeño; este paso se realiza adicionando etanol concentrado que deshidrata las moléculas de ADN y las precipita5
Dentro de los métodos más utilizados y que arroja mejores resultadosse encuentra la extracción y purificación de ADN con solventes orgánicos (Fenol/Cloroformo), pero su principal desventaja es la toxicidad de estos reactivos que los hace peligrosos para su manipulación. El otro es el Método Salting Out En este se utiliza un buffer que contiene Proteinasa K (Tris-HCl, pH 8.3, Tween 20, Nonidet P40, Proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares, liberandoa la solución los ácidos nucleicos.
Utilizaría el método de solventes orgánicos, Por ser el que mejores resultados suministra en la extracción y purificación del ADN4
B). PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Para el Control de calidad del DNA se utiliza el espectrofotómetro UV con longitudes de onda entre 260 / 280 nm (nanómetros) y los minigeles teñidos con bromuro de etidio (BrEt);visualizados con luz ultravioleta, como métodos adecuados para medir la pureza del ADN.

Cuando aislamos y purificamos ADN es necesario obtener información sobre su pureza. En la práctica la relación de absorbancia, 260 / 280 nm, es usada como una medida cualitativa de la pureza del ADN. El ADN tiene una absorbancia máxima en 260 nm, mientras que las proteínas, las cuales son las impurezas más comunesen preparaciones de ADN, tienen una absorbancia máxima de 280 nm.

Esta es la razón por la cual esas dos longitudes de onda son usadas para verificar la pureza del ADN. Si la relación está entre 1.7 y 2.0 la preparación de ADN es considerada pura porque se encuentra libre de contaminantes celulares. Una relación menor indicaría contaminación con proteínas o fenoles; valores por arriba de 2significa que hay ARN disperso1
En ocasiones los materiales que están siendo medidos contienen partículas de ligera absorbancia en suspensión más que en solución y la muestra aparece turbia como consecuencia las lecturas de absorbancia en 260 nm / 280 nm son erróneas.
Para resolver ese problema, se puede realizar una corrección. Esto significa que una lectura adicional es realizada donde el ADN noabsorbe, la más comúnmente usada es la de 320 nm.1

C). COMO MEDIRÍA SU CONCENTRACIÓN O CANTIDAD

Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA. La absorción de Uv de DNA es una característica  de la molécula, que es usada eficientemente para determinar su concentración. Cada una de las basestiene su propio y único espectro de absorción y por lo tanto contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorción de UV de una molécula de DNA. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de contribución de cada una de las bases al espectro de absorción de UV de una molécula de DNA de doble cadena de alto peso molecular (dsDNA) puede ser ignorado. Sin embargo, esas contribuciones son mássignificativas cuando se trata de oligonucleótidos y deben ser consideradas si se requiere determinar correctamente la concentración. 11
D). COMO CALCULARÍA SU COMPOSICIÓN NUCLEOTÍDICA G-C Y A-T.

Se conocen varios métodos que se pueden aplicar, entre ellos está la medición de la Absorbancia en una λ = 260 nm, estableciendo por medio de factores su cantidad correspondiente, es decir después de...