Tecnicas moleculares

TÉCNICAS MOLECULARES

A. MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

I. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

1. Fundamento teórico

▪ Introducción

En los años setenta se desarrollaron los métodos que permitieron de manera simple y relativamente rápida para determinar la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de DNA. Estos primeros intentos de secuenciar los ácidosnucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper las moléculas en pequeños fragmentos, determinar su composición de bases y deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes. Este método resulta más o menos sencillo para proteínas que resultan de la combinación de hasta veinte aminoácidos distintos, pero constituye un problema en el caso de los ácidos nucleicosdonde la secuencia resulta de la combinación de únicamente cuatro nucleótidos diferentes.
En Abril de 1983, Kary Mullis dio a conocer la Técnica de reacción en cadena de la Polimerasa o PCR que es una técnica para la síntesis "in Vitro" de secuencias específicas de DNA con la cual la insuficiente cantidad de ADN ya no es un problema en los procedimientos de Biología Molecular ni en losprocedimientos de diagnóstico basados en el estudio de DNA.

▪ Definición
Es un método que permite la amplificación directa de segmentos de ADN específicos sin clonacion, y puede utilizarse en fragmentos de ADN que estén presentes, inicialmente, en cantidades infinitesimalmente pequeñas, también podríamos decir que el metodo de PCR se basa en la amplificación de un segmento de ADN utilizandoADN polimerasa y cebadores, oligonucleotidos que hibridan con la cadena complementaria a la secuencia a amplificar. (Klug y Cummings, 5º ed)

La reaccion en cadena de la polimerasa es un metodo para amplificar una secuencia blanco de ADN. La PCR proporciona un medio sensible, selectivo y extremadamente rápido de una secuencia deseada del ADN. La especificidad se basa en el uso de dosoligonucleotidos iniciadores que hibridan con secuencias complementarias en cadenas opuestas de ADN y flanquean la secuencia blanco.
(Murray, 2004)

La técnica de PCR permite amplificar mas de mil millones de veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada de un genoma, “purificando” de formaeficiente este ADN del ADN genómico restante … Esta técnica se utiliza actualmente de forma rutinaria para clonar directamente genes de interés – partiendo tanto del ADN genómico como de ARNm purificado de células. (Alberts, 2004)

2. Procedimiento

▪ Elementos fundamentales

□ ADN molde o “template”: Es el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento, es, portanto, el ADN que la Taq polimerasa utiliza como molde para la síntesis de nuevas cadenas polinucleotídicas.

□ Desoxirribonucleótidos trifosfato(dNTPs): Sirven como elemento base o materia prima para la síntesis de la nueva cadena que va formando la Taq polimerasa. La concentración de desoxirribonucleótidos es una factor influyente en la acción de la polimerasa ya que esta debe ser igual oinferior a la concentración del MgCl2 el cual proporciona los iones Mg2+ necesarios para que la polimerasa pueda llevar a cabo su función.

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□ Cebadores (primers), oligonucleotidos: Se utilizan como cebadores para la síntesis de ADN sobre cadenas monohebras generadas al desnaturalizar el ADN calentándolo y determina el segmento de ADNque será amplificado.
-La longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y 24 bases ya que se ha comprobado que primers de mayor longitud (30-35 bases) no aumentan el rendimiento y los primers cortos carecen de suficiente especificidad.
-La relación bases púricas: bases pirimidínicas debe ser 1:1 (o como mucho 40-60%).
-La secuencia de los primers...