tecnicas moleculares

Técnicas moleculares y celulares
Juan Nicolás Duran García
Daniela Salazar Torres
Universidad de la Salle
Facultad de ciencias agropecuarias
Programa de zootecnia y medicina veterinaria
Biología
Bogotá- Colombia
Técnicas de biología molecular
Son técnicas que básicamente sirven para el análisis de proteínas y ácidos nucleicos, tienen aplicaciones en muchas ramas como la medicina,inmunología, genética, etc. Para l mayoría de las técnicas es necesario la extracción de ADN
Extracción de ADN: Se puede tomar diferentes fuentes para extraer el ADN puede ser la sangre, la saliva, hisopado vaginal, semen, orina, restos de fluidos corporales etc..Almacenamiento y conservación del ADN-. El ADN purificado refrigerado a 4° C se conserva hasta un máximo de ters años y aquellasmuestras que necesiten estar por más tiempo deben refrigerarse a 70°C
Fundamentos: complementariedad de las bases y la replicación del ADN
Herramientas: Se utilizan elementos de virus y bacterias

Figura 1: Las técnicas pueden ser directas o indirectas de Bernardo Oro Tecnicas de biologia molecular 2008)
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR
¿Qué es?
La reacción en cadena de lapolimerasa o PCR (siglas de su nombre en inglés Polymerase Chain Reaction) permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA (ácido desoxirribonulceico). El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reacción es disponer de fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a los extremos del fragmento a amplificar. Estos fragmentos servirán como cebadores para que unaenzima polimerasa sea capaz de incorporar nucleótidos complementarios a la cadena molde. Una vez completada la reacción la cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediante técnicas sencillas de separación de fragmentos de DNA. (Pérez de Castro, Ana María, Biotecnología, centro ETSIAMN, página 1)
Pasos para un análisis de PCR
La PCR está diseñada según el principio natural dereplicación del ADN. Es un proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un número específico de veces.
A) Un ciclo de PCR consiste en los siguientes pasos:
1. Desnaturalización
2. Alineación
3. Extensión
Este proceso tiene lugar en un termociclador, un instrumento que automáticamente controla y alterna las temperaturas durante períodos programados de tiempo para el númeroapropiado de ciclos de PCR (generalmente entre 30 y 40 ciclos).

Paso 1º PCR: Desnaturalización por calor.
El calor (generalmente > 90°C) separa la doble hebra de ADN en dos filamentos, esto se conoce como “desnaturalización".
Puesto que los enlaces del hidrógeno que unen las bases de uno a otro son débiles, se rompen a altas temperaturas, mientras que los enlaces entre fosfatos ydesoxirribosa, que son enlaces covalentes más fuertes, permanecen intactos.
Ciclo PCR - Paso 1º: Desnaturalización por calor

Paso 2º PCR: Alineación – unión de la sonda a la secuencia diana.
El objetivo no es replicar la hebra entera de ADN sino replicar la secuencia diana de aproximadamente 100-600 pares de bases que es única en el organismo.
Los iniciadores marcan el final de la secuenciadiana: éstos son sintéticos y cortos, creados a partir de una hebra única de ADN y que normalmente constan de 20-30 bases, con una marca de biotina 5’ al final para ayudar a la detección.
Temperatura de Alineación: generalmente ocurre entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud y la secuencia de bases de los iniciadores. Permite que éstos se unan a la secuencia diana con alta especificidad.Ciclo PCR - Paso 2º: Un par de iniciadores biotinilados se unen al final de la secuencia diana

Paso 3º PCR: Extensión
Una vez que los iniciadores se han unido a las secuencias complementarias de ADN, la temperatura se eleva aproximadamente a 72°C y la enzima Taq polimerasa replica los filamentos de ADN.
La Taq ADN polimerasa es una ADN polimerasa recombinante termoestable del organismo...