Tecnología del hibridoma

Tecnología del hibridoma
Los hibridomas son células híbridas resultantes de la fusión de células extraídas del bazo de un animal (linfocitos) con células cancerosas inmortales y de reproducción rápida (mielomas). Esta técnica es utilizada para la producción de anticuerpos mono nucleados.
La respuesta normal en lo que concierne a anticuerpos a cualquier molécula que se ha introducido natural oartificialmente es compleja (policlonal) y da como resultado la formación de una mezcla de diferentes anticuerpos contra cualquiera de los sitios antígenos (pueden formarse anticuerpos contra azúcares, proteínas o lípidos o combinaciones de ellos). La principal ventaja de la producción de anticuerpos monoclonales es que la respuesta policlonal compleja descrita puede separarse en sus componentesindividuales. Sin embargo dado que las células que los albergan sólo viven unos pocos días requiere que las células manipuladas se tornen en inmortales.
La primera fase en la producción de anticuerpos monoclonales (o mononucleados) consiste en preparar el antígeno (seleccionando especificidades individuales mediante fusión celular), éstos son purificados parcialmente, vgr por disgregaciónsub-celular, lavado con un disolvente apropiado (elución) de bandas proteínicas a partir de geles de acrilamida o enriquecimiento cromotográfico.
Posteriormente, se inocula al animal en cuestión con los antígenos seleccionados, de suerte que cada linfocito produzca un anticuerpo específico; cada uno de ellos (normalmente mortal) es posteriormente, inmortalizado por la fusión con un mieloma (célulacancerosa, de reproducción indefinida y rápida). La célula resultante con una nueva carga genómica, guarda su especificidad en la producción de anticuerpos homogéneos (y únicos, de allí su denominación de anticuerpos monoclonales) al originar un clon de nuevas células, con la rapidez del mieloma.
El hibridoma productor del anticuerpo monoclonal para poder ser analizado para su utilización dependiendo de la unión directa del anticuerpo con su antígeno, la cual no es fácil de detectar, por lo que se le adiciona un segundo anticuerpo marcado ya sea con una molécula fluorescente, un isótopo radiactivo, o con una enzima que posee un producto de reacción coloreada; de esta manera puede detectarse la unión de un anticuerpo monoclonal con su antígeno, una vez que la cavidad que contiene el anticuerpodeseado es identificada, las células tienen que clonarse para tener la certeza de que todas proceden de un sólo producto de fusión (lo que se logra reduciendo, por dilución, a una las células de cada cavidad para que cuando vuelvan a crecer los sobrenadantes de esos clones correspondan a un único origen), asegurado lo cual el producto se congela en nitrógeno líquido para su almacenamiento.
Aunqueexisten numerosas variantes para la obtención de hibridomas y Ac Mc específicos, el protocolo general tiene las siguientes etapas:
* Clon de células específicas (Inmortalidad) 1. Como célula de mieloma parenteral se selecciona una mutante enzimo-dependiente de una línea celular de plasmocitoma. Habitualmente se usan células deficientes en hipoxantin-guanin-fosforribosil-transferasa (HGFRT-).Se cultivan en un medio que contiene dicha enzima.
* Anticuerpos específicos (cel. bazo) 2. Las células parentales productoras de anticuerpos se obtienen del bazo (o de la población linfocitaria de sangre periférica) de un animal inmunizado con el antígeno frente a cuyos epitopes se desea obtener anticuerpos monoclonales.3. Ambos tipos de células parentales se mezclan en polietilenglicoldurante 1 minuto. Se produce la fusión celular y se originan los hibridomas.4. Tras un lavado y unas horas de incubación, se procede a la dilución y clonado de la suspensión celular, sub cultivando durante varias semanas en un medio desprovisto de HGFRT. Las células no fusionadas mueren en este medio y cada uno de los hibridomas da lugar a un clon.5. Los sobrenadantes de cada clon celular son...