Tecnolog a del Hibridoma

Tecnología del Hibridoma
Un hibridoma es una línea celular híbrida obtenida mediante la fusión de un linfocito B productor del anticuerpo específico de interés, con una línea celular de mieloma (linfocito B canceroso) que no produce una inmunoglobulina propia. Se obtiene así una línea celular inmortal capaz de producir el anticuerpo monoclonal de interés, que puede recuperarse del medio.Método
Los animales de laboratorio expuestos primero a un antígeno al que estamos interesados en el aislamiento de un anticuerpo contra. Por lo general, esto se realiza mediante una serie de inyecciones del antígeno en cuestión, en el transcurso de varias semanas. Una vez que se aíslan esplenocitos del bazo del mamífero, las células B se fusionan con células de mieloma inmortalizadas. Las células demieloma se seleccionan de antemano para asegurar que no son anticuerpo secretor de sí mismos y que carecen del gen de hipoxantina-guanina, haciéndolos sensibles al medio HAT. La fusión se lleva a cabo utilizando polietilenglicol o el virus de Sendai. Se lleva a cabo haciendo que las membranas celulares más permeables.
Las células fusionadas se incuban en medio HAT de aproximadamente 10 a 14 días. Laaminopterina bloquea la vía que permite la síntesis de nucleótidos. Por lo tanto, las células de mieloma no fusionadas mueren, ya que no pueden producir nucleótidos por la de novo o vías de salvamento, ya que carecen de HGPRT. La eliminación de las células de mieloma no fusionadas es necesario debido a que tienen el potencial de superar otras células hibridomas, especialmente débilmenteestablecidos. Las células no fusionadas B morir, ya que tienen una vida corta. De esta manera, sólo los híbridos de células de mieloma-B sobrevivir, ya que el gen HGPRT procedente de las células B es funcional. Estas células producen anticuerpos y son inmortales. El medio incubada se diluye a continuación en placas de múltiples pocillos en un grado tal que cada pocillo contiene una sola célula. Dado que losanticuerpos en un lugar bien son producidos por la misma célula B, que será dirigido hacia el mismo epítopo, y por lo tanto son anticuerpos monoclonales.
La siguiente etapa es un proceso de cribado primario rápido, que identifica y selecciona sólo aquellos hibridomas que producen anticuerpos de la especificidad apropiada. El sobrenadante del cultivo de hibridoma, enzima secundario marcadoconjugado, y el sustrato cromogénico, se incuban a continuación, y la formación de un producto de color indica un hibridoma positivo. Alternativamente, la detección inmunocitoquímica también se puede utilizar.
La célula B que produce los anticuerpos deseados se pueden clonar para producir muchos clones hijas idénticas. Medios suplementarios que contienen la interleucina-6 son esenciales para este paso.Una vez que se establece una colonia de hibridoma, que continuamente crecer en medio de cultivo como el medio RPMI-1640 y producir anticuerpos.
Placas de pocillos múltiples, se utilizan inicialmente para cultivar los hibridomas, y después de la selección, se cambian a grandes matraces de cultivo tisular. Esto mantiene el bienestar de los hibridomas y proporciona suficientes células para lacrioconservación y el sobrenadante para investigaciones posteriores. El sobrenadante del cultivo puede producir 1 a 60 g/ml de anticuerpo monoclonal, que se mantiene a -20 º C o inferior hasta su uso.
Mediante el uso de sobrenadante de cultivo o una preparación de inmunoglobulina purificada, un análisis más detallado de un potencial de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal se puede hacer entérminos de reactividad, especificidad y reactividad cruzada.

La capacidad del cuerpo humano para defenderse contra las agresiones externas, e incluso contra ciertas agresiones internas, como el propio cáncer, conforma el sistema inmunológico de cada individuo. Lamentablemente, no siempre producimos anticuerpos para combatir dichas agresiones. El descubrimiento de ciertas células especiales creadas...