Tecnologia sobre luciferasa

Luciferasa
GB 9405750.2 19940323 GB 9501170.6 19950120
Campo técnico

[0001]
Nueva proteína con actividad de la luciferasa, y la presente invención se refiere a una codificación de ADN del vector y la expresión de la proteína. En particular, la presente invención proporciona una luciferasa que tiene estabilidad térmica a temperaturas superiores a 30 ℃.
[0002]
ATP, Mg luciferasa deluciérnaga, 2 + cataliza la oxidación de luciferina en presencia de oxígeno molecular y generar resultados de luz. [McElroy y (1978) McElroy y Seliger (1960) y ver DeLuca], se utiliza en (luminométrica) Medición de luminiscencia ensayo para medir el nivel de ATP es la luz que emiten las características es aproximadamente 0,88 rendimiento cuántico de esta reacción .
[0003]
Luciferasa ser obtenida porexpresión a partir de microorganismos que albergan el constructo de ADN recombinante que codifica la enzima o, alternativamente, se puede obtener directamente desde el cuerpo del insecto, tales como gusano de luz o de luciérnaga. Y importantes especies de luciérnaga de cuatro puede obtener ADN que puede obtener esta enzima, o que codifica la enzima, luciérnaga Luciola mingrelica HEIKE Luciolalateralis y luciérnaga Luciola cruciata de Japón, Europa del Este, luciérnaga en América del Norte (Photinus es pyralis). Lampyris noctiluca luciérnaga es también uno de la fuente de luciferasa, la secuencia de aminoácidos de la luciferasa tiene 84% de homología con los de Photinus pyralis.
[0004]
La estabilidad térmica de la luciferasa recombinante es una en la que su actividad, tales como perdido tanrápidamente es más de 30 ℃ luciferasa éstos, cuando se expone a una temperatura superior a 35 ℃ y, en particular, la luciferasa de tipo silvestre. Cuando se almacena o se usa a alta temperatura ambiente, la enzima, tal inestabilidad es una desventaja de la enzima o si es necesario para aumentar la velocidad de reacción por calentamiento. Nakano y (Kajiyama, Biochemistry 32, pp, que puedenestabilizarse contra la inactivación por calor de la luciferasa si se sustituye por residuos de treonina residuo de isoleucina están mutados en la posición 217 de la luciferasa de luciérnaga japonesa es conocida 0,13795-13799, 1993). En la forma descrita anteriormente, se incrementa la actividad específica y el pH de estabilidad de la enzima y el calor. Aún no se ha informado de la estabilización térmicade Luciola mingrelica y Photinus pyralis.
[0005]
Aquí, por el ácido glutámico presente en la secuencia de ambos Photinus pyralis, Luciola mingrelica, de Luciola cruciata y Luciola lateralis para guardar aminoácido alternativo (glutamato) residuo, se sustituye con arginina o lisina en particular, los presentes inventores han encontrado que salvaje Ofrezco una novela luciferasa con una estabilidadtérmica mayor que el tipo de la luciferasa. El glutamato las que se encuentran en la posición 354 de la luciferasa de Photinus pyralis, que es el tercero de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos conservada TPEGDDKPGA encontrado en la luciferasa de las otras especies y las especies.
[0006]
Es decir, en una forma de realización, la primera, una proteína que tiene actividad de la luciferasa,la presente invención proporciona una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de homología de más de 60% a una proteína tal Luciola lateralis Photinus pyralis, Luciola mingrelica, o Luciola cruciata Se proporciona, esta proteína se caracteriza por Luciola mingrelica o residuo 354 de la luciferasa de Photinus pyralis, el residuo de aminoácido correspondiente al residuo 356 de Luciolalateralis luciferasa y Luciola cruciata es un aminoácido distinto de ácido glutámico.
[0007]
Puede ser uno de los llamados ácidos y análogos de ácidos o modificaciones del aminoácido natural aminoácidos naturales aminoácidos no comunes también puede ser un aminoácido que se produce naturalmente. Se entiende que los análogos de aminoácidos distintos de ácido glutámico, y es un compuesto que es...