Tema: Digestion De Enzimas De Restriccion Del Adn Lambda

TEMA: DIGESTION DE ENZIMAS DE RESTRICCION DEL ADN LAMBDA
 
Objetivo General
Realizar diferentes cortes específicos en secuencias de ADN mediante enzimas de restricción.

Objetivos específicos
Demostrar que estas enzimas (EcoR1 y Hind III) reconocen secuencias nucleotídicas especificas palíndromas
Reconocer el lugar exacto en que las enzimas EcoR1 y Hind III hacen los cortes
Verificarel tipo de corte que realiza cada enzima
Comprobar el tamaño de los fragmentos obtenidos de los cortes de las enzimas

Observaciones
Las enzimas de restricción son verdaderas herramientas utilizadas en el laboratorio para cortar el ADN
Los fragmentos deben tener siempre los mismos tamaños porque el sitio de corte de las enzimas de restricción es exacto
Las secuencias de reconocimientode EcoR1 y Hind III deben estar conformadas de 4 a 6 pares de bases, lo que coincidió con la información de la enzima de restricción

Discusión
Las enzimas de restricción también conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a partir de una secuencia que reconocen.
La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica (secuencia que se lee igual en ambas direcciones).
Sonextraídas de organismos procarioticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar si ADN, lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y propio. Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII y EcoRI, toman el nombre de las bacterias que la producen:
Ejemplo:EcoRI: E = gênero Escherichia.
co = espécie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Las enzimas de restricción no pueden cortar ADN metilado, de tal manera que solo afectan el ADN extranjero y no el bacterial. Al cortar ADN pueden producir dos tipos de cortes: cohesivos o pegajosos que cortan a manera escalonada en dos puntosdiferentes; y los abruptos que cortan en un solo punto.


Electroforesis de AND: después de tratar el ADN lambda con las diferentes enzimas, los fragmentos son separados por su tamaño usando un gel de electroforesis
Luego que el gel se corre el ADN se tiñe para revelar los patrones de bandas formados en el gel que corresponden a fragmentos de diferentes tamaños

Resultados
Podemos observar queEcoR1 reconoció 6 fragmentos de ADN y en Hind III se reconoció 7 fragmentos de ADN

EcoRI HindIII
21226 23130
7421 9416
5804 6682
5643 4361
4878 2322
3530 2027
564


Cuestionarios

Que es el fago lambda?
También conocido como bacteriófago lambda es un virus que infecta a la bacteria E. coli; descubierto en 1950. Se trata de un virus complejo de DNA lineal bicatenario.

ElDNA del fago lambda es una molécula linear de 48,5 kb. Contiene un DNA de aproximadamente 48.502 bp que terminan por dos extremos adhesivos y que están constituidos por 12 nucleótidos; que se denominan “secuencia cos”, de apareo bien sólido, conteniendo en efecto 10 G ó C.
Los cos permiten a la molécula de ADN circularizarse cuando es introducida en una bacteria.


Que son las enzimas derestricción?
Son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

Las aplicaciones de las enzimas de restricción son:
Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.
Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y“Northern” blotting.
Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.

Sitios de reconocimiento, corte y microorganismo del cual se aislaron las enzimas de restricción EcoRI y HindIII.

Enzima Secuencia y sitio de reconocimiento Microorganismo
EcoRI G↓AATTC Escherichia coli RY13
HindIII A↓AGCTT Haemophilus influenzae R_d
El sitio...