TESIS_MASTER
Páginas: 97 (24167 palabras)
Publicado: 9 de noviembre de 2015
MÁSTER EN PRODUCCIÓN ANIMAL
DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE
UN MÉTODO ANALÍTICO DE
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA EFICACIA CON DETECCIÓN
POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS
PARA LA DETERMINACIÓN DE
ANTIINFLAMATORIOS NO
ESTEROIDEOS EN LECHE Y TEJIDO
MUSCULAR DE ORIGEN ANIMAL
Tesis de Máster
Valencia, Septiembre 2012
Ana Giménez Pérez
Director:
Dr. Francisco Moragues Ribes
Directora:
Dra. Pilar HernándezPérez
ÍNDICE
3
RESUMEN
7
INTRODUCCIÓN
11
1. Descripción del Centro Superior de Investigación en Salud Pública (CSISP) –
Laboratorio de Salud Pública de Valencia (LSPV).
13
2. Residuos de medicamentos veterinarios.
15
2.1. Legislación y normativas sobre residuos de medicamentos de uso veterinario. 15
2.2. Análisis y controles realizados en la Unidad de Residuos de medicamentosveterinarios del LSPV.
19
3. Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs).
3.1. Clasificación de los antiinflamatorios no esteroideos.
3.2. Legislación y control de la utilización de antiinflamatorios no esteroideos.
3.3. Metodologías para el análisis de antiinflamatorios no esteroideos.
21
23
24
27
4. Cromatografía líquida rápida de alta eficacia asociada a espectrometría de masas
(UPLC-MS/MS).
4.1.Técnica de cromatografía líquida (LC).
4.2. Introducción a la espectrometría de masas (MS).
4.3. Acoplamiento LC-MS.
4.4. Equipos de espectrometría de masas tipo MSn o MS/MS.
30
30
31
33
35
OBJETIVOS
37
MATERIALES Y MÉTODOS
41
1. Procedimiento para la validación de métodos analíticos.
1.1. Introducción.
1.2. Definiciones.
1.3. Determinación y cálculo de los parámetros de validación.
43
43
4446
2. Descripción del método analítico desarrollado para la determinación de
antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en músculo y leche por UPLC-MS/MS.
2.1. Alcance del método.
2.2. Materiales, reactivos y equipos.
2.3. Preparación de los patrones, la muestra y el cromatógrafo.
2.4. Realización del método.
2.5. Tratamiento y expresión de los resultados.
2.6. Control de calidad.
48
48
48
50
52
5658
5
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
59
1. Desarrollo de un método analítico para la determinación de antiinflamatorios no
esteroideos (AINEs) no autorizados en sanidad animal en leche.
61
2. Determinación de carboxiibuprofeno, piroxicam, naproxeno, oxifenilbutazona, ácido
niflúmico, flurbiprofen, suxibuzona, indometacina, fenilbutazona, ácido mefenámico,
ácido flufenámico y ácido meclofenámico, enleche y tejido muscular por UPLCMS/MS.
64
2.1. Validación del método.
77
2.2. Comparación de los límites establecidos con los de otras metodologías analíticas.
84
2.3. Control del factor respuesta.
85
2.4. Control de los patrones internos de las muestras.
85
2.5. Confirmación.
89
CONCLUSIONES
91
BIBLIOGRAFÍA
95
ANEXO
101
6
RESUMEN
7
Se ha desarrollado un método analítico para ladeterminación de 12
antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en leche y tejido muscular de origen animal.
Los AINEs investigados son los siguientes: carboxiibuprofeno (CXIBP), piroxicam
(PIR), naproxeno (NPX), oxifenilbutazona (OPBZ), ácido niflúmico (NFL),
flurbiprofen (FBP), suxibuzona (SBZ), indometacina (IND), fenilbutazona (PBZ), ácido
mefenámico (MEF), ácido flufenámico (FFA) y ácidomeclofenámico (MCF). Los 12
AINEs determinados son fármacos no autorizados en animales productores de alimentos
y no tienen Límite Máximo de Residuos (LMR), pero se han tenido en cuenta los
Límites mínimos de funcionamiento exigidos (MRPL) que se recomiendan para 4 de
ellos (MEF, PBZ, NPX y OPBZ).
Las principales dificultades para la extracción y determinación de AINEs de
matrices biológicas son lapresencia de grasa y las estrechas interacciones de estos
fármacos con las proteínas. Se han probado varios procedimientos para la extracción y
purificación de las muestras de leche, obteniendo las mejores recuperaciones de los
analitos mediante una extracción con metanol y la utilización de cartuchos de SPE
(Extracción en Fase Sólida). El procedimiento de preparación de las muestras de tejido...
DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE
UN MÉTODO ANALÍTICO DE
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA EFICACIA CON DETECCIÓN
POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS
PARA LA DETERMINACIÓN DE
ANTIINFLAMATORIOS NO
ESTEROIDEOS EN LECHE Y TEJIDO
MUSCULAR DE ORIGEN ANIMAL
Tesis de Máster
Valencia, Septiembre 2012
Ana Giménez Pérez
Director:
Dr. Francisco Moragues Ribes
Directora:
Dra. Pilar HernándezPérez
ÍNDICE
3
RESUMEN
7
INTRODUCCIÓN
11
1. Descripción del Centro Superior de Investigación en Salud Pública (CSISP) –
Laboratorio de Salud Pública de Valencia (LSPV).
13
2. Residuos de medicamentos veterinarios.
15
2.1. Legislación y normativas sobre residuos de medicamentos de uso veterinario. 15
2.2. Análisis y controles realizados en la Unidad de Residuos de medicamentosveterinarios del LSPV.
19
3. Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs).
3.1. Clasificación de los antiinflamatorios no esteroideos.
3.2. Legislación y control de la utilización de antiinflamatorios no esteroideos.
3.3. Metodologías para el análisis de antiinflamatorios no esteroideos.
21
23
24
27
4. Cromatografía líquida rápida de alta eficacia asociada a espectrometría de masas
(UPLC-MS/MS).
4.1.Técnica de cromatografía líquida (LC).
4.2. Introducción a la espectrometría de masas (MS).
4.3. Acoplamiento LC-MS.
4.4. Equipos de espectrometría de masas tipo MSn o MS/MS.
30
30
31
33
35
OBJETIVOS
37
MATERIALES Y MÉTODOS
41
1. Procedimiento para la validación de métodos analíticos.
1.1. Introducción.
1.2. Definiciones.
1.3. Determinación y cálculo de los parámetros de validación.
43
43
4446
2. Descripción del método analítico desarrollado para la determinación de
antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en músculo y leche por UPLC-MS/MS.
2.1. Alcance del método.
2.2. Materiales, reactivos y equipos.
2.3. Preparación de los patrones, la muestra y el cromatógrafo.
2.4. Realización del método.
2.5. Tratamiento y expresión de los resultados.
2.6. Control de calidad.
48
48
48
50
52
5658
5
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
59
1. Desarrollo de un método analítico para la determinación de antiinflamatorios no
esteroideos (AINEs) no autorizados en sanidad animal en leche.
61
2. Determinación de carboxiibuprofeno, piroxicam, naproxeno, oxifenilbutazona, ácido
niflúmico, flurbiprofen, suxibuzona, indometacina, fenilbutazona, ácido mefenámico,
ácido flufenámico y ácido meclofenámico, enleche y tejido muscular por UPLCMS/MS.
64
2.1. Validación del método.
77
2.2. Comparación de los límites establecidos con los de otras metodologías analíticas.
84
2.3. Control del factor respuesta.
85
2.4. Control de los patrones internos de las muestras.
85
2.5. Confirmación.
89
CONCLUSIONES
91
BIBLIOGRAFÍA
95
ANEXO
101
6
RESUMEN
7
Se ha desarrollado un método analítico para ladeterminación de 12
antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en leche y tejido muscular de origen animal.
Los AINEs investigados son los siguientes: carboxiibuprofeno (CXIBP), piroxicam
(PIR), naproxeno (NPX), oxifenilbutazona (OPBZ), ácido niflúmico (NFL),
flurbiprofen (FBP), suxibuzona (SBZ), indometacina (IND), fenilbutazona (PBZ), ácido
mefenámico (MEF), ácido flufenámico (FFA) y ácidomeclofenámico (MCF). Los 12
AINEs determinados son fármacos no autorizados en animales productores de alimentos
y no tienen Límite Máximo de Residuos (LMR), pero se han tenido en cuenta los
Límites mínimos de funcionamiento exigidos (MRPL) que se recomiendan para 4 de
ellos (MEF, PBZ, NPX y OPBZ).
Las principales dificultades para la extracción y determinación de AINEs de
matrices biológicas son lapresencia de grasa y las estrechas interacciones de estos
fármacos con las proteínas. Se han probado varios procedimientos para la extracción y
purificación de las muestras de leche, obteniendo las mejores recuperaciones de los
analitos mediante una extracción con metanol y la utilización de cartuchos de SPE
(Extracción en Fase Sólida). El procedimiento de preparación de las muestras de tejido...
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