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MICROSCOPÍA LÁSER CONFOCAL
Ángel Martínez Nistal
Servicio de Proceso de Imágenes. Universidad de Oviedo

1.- INTRODUCCIÓN
La microscopía láser confocal es una nueva técnica de observación microscópica que
está logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biología,
materiales, geología, etc.) Su éxito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a lamicroscopía óptica tradicional (imágenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolución
vertical y horizontal, etc.) y, sobre todo, a la posibilidad de obtener "secciones ópticas" de
la muestra, lo que permite su estudio tridimensional.
Aunque el principio de la microscopía confocal fue patentado hace varios años
(Minsk, 1957) y los primeros microscopios basados en esta técnica que demostraron suvalidez fueron descritos por Petran et al. en 1968, su gran aceptación y espectacular
desarrollo no ha tenido lugar hasta hace unos pocos años con el desarrollo del láser y de los
ordenadores personales.
La mayor parte de las muestras observadas con microscopía óptica son traslúcidas o,
en el caso de ser opacas, su superficie de reflexión no se encuentra perfectamente pulida.
En ambos casosla luz interacciona con la muestra a varias profundidades por lo que la
imagen que llega al observador presenta áreas borrosas debidas a la luz procedente de
zonas fuera del plano de enfoque, lo que produce una degradación en el contraste y
resolución de la imagen (figura 1 A).

Fig. 1. (A). Imagen de microscopía óptica de fluorescencia de un alga (Spyrogira).
(B) Imagen del mismo tipo demuestra (Spyrogyra) obtenida con el microscopio
confocal.

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Técnicas de imagen en biología

El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reflejada o
fluorescente procedente de los planos fuera de foco (figura 1 B). Para ello se ilumina una
pequeña zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal,
eliminándose los haces procedentes de losplanos inferiores y superiores (Boyde, 1988).

Detector

Diafragma
(pinhole)

Fuente de iluminación

Espejo dicroico

Luz en foco
Luz fuera de foco

Objetivo

Plano focal
Especimen

Fig. 2. Esquema del principio de la microscopía confocal. La luz procedente de los
puntos fuera del plano focal es eliminada por el diafragma o pinhole.

2.- BASES INSTRUMENTALES
Parte de la luzprocedente de la fuente de iluminación atraviesa un primer diafragma,
es reflejada mediante un espejo dicroico y se enfoca en un punto del espécimen mediante
la lente de un objetivo. La señal emitida por el punto iluminado (fluorescencia o luz
reflejada) vuelve por el mismo camino óptico, pasa a través del espejo dicroico y es
enfocada en un detector, un segundo diafragma o pinhole es colocadodelante del detector
para eliminar las señales procedentes de la zona fuera de foco (Figura 2).
El principio del funcionamiento del Microscopio Confocal se basa en la existencia
de dos diafragmas (pinhole), uno entre la fuente de luz y el objetivo y el otro entre el
objetivo y el detector. Ambos pinhole deben de estar perfectamente alineados de forma que
el segundo de ellos únicamente dejellegar al detector la luz procedente del plano focal.
La utilización de un láser como fuente de luz permite focalizar la iluminación en una
región muy pequeña de la muestra y con una gran intensidad.

Microscopía láser confocal

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Dado que sólo se ilumina una pequeña zona de la muestra (punto), para poder
visualizarla se necesita un sistema de barrido que permita muestrear todos lospuntos y un
sistema de formación de la imagen donde se recoja la información de cada uno de estos
puntos. El sistema de barrido puede ser de dos tipos: que el haz del láser se desplace por la
muestra (beam scanning) o que sea ésta la que se desplace, mientras el haz permanece
inmóvil (stage scanning) (Wright, et al, 1993). El primer tipo es el más comúnmente
empleado, tiene la ventaja de una...