Tincion De Gram

Tinción de Gram
Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra liquido cerebroespinal. Si hubiera una especia de bacteria Gram negativaapareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infección.

Una tinción Gram en la que observamos un mezclado de Staphylococcus aureus (coco Gram positivo) y Escherichia coli (bacilo Gram negative)
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre albacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
Metodologia
•Recoger muestras.
• Hacer el extendido en espiral.
• Dejar secar a temperatura ambiente.
• Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)
• Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura.
• Enjuagar con agua.
• Agregar lugol y esperar entre 1minuto.
• Enjuagar con agua.
• Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloracion)
• Enjuagar con agua.
• Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
• Enjuagar con agua.
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.Explicación
El cristal violeta(colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared dela célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las célulasGram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto lasbacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes devioleta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo...