Tincion de gram

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**TINCION DE GRAM**

La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños, morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de lamuestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura celular.

LAS BACTERIAS GRAM (+)
Tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos que no son afectados por la decoloración con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo yvisualizándose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular está intacta o dañada (por tratamientos antibióticos, edad celular…).

LAS BACTERIAS GRAM (–)
Tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es dañada por el alcohol y/oacetona de la decoloración, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante.

Se divide en:

**PROCEDIMIENTO**

PREPARACIÓN DE LA EXTENSIÓN:
De elección sería utilizar portas mantenidos en un contenedor con alcohol, los cuales se sacan y secan (al aire o por flameado) justo antes de su uso. La extensión debe de rendir una fina monocaparepresentativa de la muestra:
(Torundas:   hacerlas rodar ligeramente sobre el porta para evitar la destrucción de elementos celulares y bacterias. Dejar secar al aire.
 (Aspirados, exudados, esputos, heces, ... (muestras sin torundas):   seleccionar las partes más purulentas y/o hemáticas, y tras depositar una pequeña fracción (con un asa, torunda, aplicadores estériles…) hacer la extensión con2 portas

FIJACIÓN:
La extensión puede fijarse con calor o metanol:
(Calor:   se realiza sobre superficies calientes (hasta 60ºC) por paso directo de 2 a 3 veces a través de la llama, o por adición de unas gotas de alcohol sobre porta y posterior encendido hasta extinción de la llama. Evitar lo posible el sobrecalentamiento. Esperar a que el porta se enfríe antes de su tinción.

Tinción:  Existen varias modificaciones de ésta según reactivos recomendados, tiempos de tinción y usos para la que se destine.

Bacteriología en general:  
Se utiliza la modificación de Hucker, la cual utiliza 30 seg. El cristal violeta, 30 seg. la solución iódica de Gram (lugol + bicarbonato sódico diluido), de 1 a 5 seg. la solución decoloradora de alcohol-acetona (1:1), y 30 seg. la safranina ofucsina básica al 0,1-0,2%.  A tener en cuenta que los tiempos de decoloración son el paso crítico.  Según éstos hay 3 tipos de decoloración:

( Decoloración moderada (de 1 a 5 seg.): Es la inicialmente reseñada y, en general, la más recomendada.

(Decoloración rápida (lavar inmediatamente después de aplicarla): Sólo con acetona. Utilizada por personal cualificado y se usa si la muestra contienegran número de células acompañantes.

( Decoloración lenta (30 seg.): Solo con alcohol de 95º. Es la preferida por estudiantes y personal con menos experiencia.

**TECNICA**

(Mechero
(Asa
(Desinfectante
(Microscopio. Laminilla y cubre-objeto
(Bandeja para hacer tinción.

(Cristal Violeta
(Iodolugol
(Alcohol o descolonizante.
(Safranina
(Agua.

(Microscopio.

(Material((Equipo(

(Reactivo(

1.- Limpia bien la laminilla con agua y jabón. Puedes utilizar unas pinzas para calentar la laminilla en el mechero.

2.-Desinfecta el asa ( aguja de inocular) en el mechero. Obtén el cultivo con los microorganismos: estos pueden estar en caldo (tubo con líquido) o pueden estar sembrados en agar nutriente (placa Petri con medio que se ve sólido). Con el asa (desinfectada)...