Tincion de Gram

Materiales y reactivos

Cultivos de bacterias Gram (+) y Gram (-)
Portaobjetos
Papel absorbente
Puente de coloración
Mecheros
Aceite de inmersión
Cristal violeta
Lugol
Safranina
Alcohol acetona
Asas
Microscopio
Agua destilada
Procedimiento






Observaciones coloración de Gram
Al tomar un portaobjetos con una gota de solución salina y luego extender y fijar la muestra,notamos que adicionándole cristal violeta la placa adquiría un color morado fuerte propio del anterior reactivo al pasar un minuto de su adición cuyo exceso fue lavado con agua. Fue cubierto con solución yodada (lugol) durante un minuto y lavado con agua nuevamente permaneciendo aun el color morado en menor intensidad, este se retiro completamente al decolorar durante 15 segundos con alcoholacetona. Repetimos el lavado con agua para cubrir el extendido con safranina (roja) que actuó durante un minuto. Antes de proceder a la visualización en el microscopio con el objetivo de 100x, por última vez lavamos la placa con agua, secamos al ambiente y agregamos una gota de aceite de inmersión, permitiéndonos ver para:
Muestra 1
El ocular mostro una distribución en toda la placamicroorganismos en forma alargada que se distribuían por toda la superficie, además poseían un color rosado tenue. Algunos estaban en pequeños grupos y otros dispersos en el portaobjetos.
Muestra 2
Vimos a través del ocular varios microorganismos de forma circular que se agrupaban distribuyéndose en toda la superficie del portaobjetos. Se caracterizaban pues tenían una coloración azul fuerte.Analisis de resultados
La tinción de Gram es un método que permite clasificar bacterias en Gram-positivas y Gram-negativas que tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana queconfiere rigidez es el peptidoglicano. Para las Gram negativas se tiene una tinción de color rosado tenue, mientras que para las Gram positivas de obtiene un color azul fuerte.
Ahora bien, durante el proceso de tinción de Gram, las células fijadas con calor sobre el portaobjetos se tiñen, inicialmente con una solución de cristal violeta y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. Eneste primer paso, todas las células, tanto las Gram positivas como las Gram negativas, están teñidas de azul lo que no permite aun su diferenciación. La solución yodada (lugol) es una disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico KI en agua destilada, en donde el elemento activo es el I2 que entra en las células formando un complejo insoluble con el cristal violeta, nuevamente las célulastanto Gram positivas y Gram negativas no pueden ser identificadas.
Llevando cabo la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona durante 15 segundos, en donde es soluble el complejo I2-cristal violeta, se obtienen diferentes resultados para la muestra 1 y 2.
Para la muestra 1 ocurre una decoloración ya que la membrana externa de los organismos bacilares que teníamos en la muestra essoluble a solventes orgánicos como lo es la muestra alcohol acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiada delgada para mantener el complejo cristal violeta/yodo que se formo previamente y por lo tanto este complejo se escapa perdiéndose la coloración azul-violácea. De este modo las células están transparentes por lo que se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorantede color rojo, como la safranina, que deja finalmente el color rosado tenue que se observa en dichos microorganismos bacilares con lo que concluye que esta muestra poseía bacterias Gram negativas.
Por otro lado, para la muestra 2 no hay decoloración con el alcohol acetona al poseer una pared celular mas resistente y con mayor proporción de peptidoglicano, no son susceptibles a la acción del...