Tincion Gram

TINICION DE GRAM
 Recoger muestras.
 Hacer el extendido en espiral.
 Dejar secar a temperatura ambiente.
 Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 vecesaprox.)
 Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura.
 Enjuagar con agua.
 Agregarlugol y esperar entre 1 minuto.
 Enjuagar con etanol.
 Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloración)
 Enjuagar con agua.
 Tinción de contrasteagregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
 Enjuagar con agua.
Para observar al microscopio óptico es convenientehacerlo a 100x con aceite de inmersión.
EXPLICACIÓN
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la paredbacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta sefije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que seagrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración decontraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de...