Tinciones Diferenciales

TINCIONES DIFERENCIALES

Objetivos:

* Realizar tinciones diferenciales de bacterias (Gram y Ziehl Nieelsen).

* Reconocer y diferenciar bacterias Gram positivas, Gram negativas, Bacterias Ácido-Alcohol Resistentes y Bacilos Ácido-Alcohol No Resistentes.

Fundamentos teóricos
Los distintos tipos de bacterias son diferenciales, es decir, se diferencian por la composición de lapared celular, la estructura y la función de la misma.

PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjeto de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen nítida y clara al microscopio. Este frotis debe ser posteriormentefijado al vidrio del portaobjeto para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada con los sucesivos lavados.
La fijación de una extensión bacteriana hace que las mismas queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible su morfología y las posibles agrupaciones de células que puedanhaber.

REALIZACIÓN DE UN FROTIS
1) Colocar una gota de agua en el centro de un portaobjeto limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua que resulta suficiente.
2) Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad de cultivobacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra,directamente sobre el portaobjeto.

3) Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.

FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETO
Por CALOR: pasar tres veces el portaobjeto por la llama del mechero durante unossegundos.Dejar enfriar el porta entre los sucesivos pases.
Por METANOL: para bacterias procedentes de medios líquidos; añadir unas gotas de metanol sobre la extensión completamente seca. Golpear el portaobjeto por su canto con cuidado para retirar de inmediato ele xceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente.
Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, laspreparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.

TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO
1) Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlo actuar durante el tiempo que se indique para cada tinción. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En ocasiones, el colorante tiñe solo en caliente, por lo que el tiempo que dure suactuación se deberá sostener el portaobjeto con una pinza sobre la llama del mechero para que humée el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se producirá la destrucción de las células.

2) Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza inclinando el portaobjeto y aplicando el chorro de agua en la parte superior del mismo demanera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo.

3) Eliminar la máxima cantidad de agua de los porta golpeándolos por sus cantos con cuidado contra una superficie.

4) Secar el portaobjeto presionando entre dos papeles de filtro, pero en ningún momento se debe frotar el porta.

5) Observar la...