Tinciones gram

PRÁCTICA 2

“TINCIONES (COLORACIONES)”

INTRODUCCION

Las tinciones fueron creadas, al principio, para observar mejor la morfología de los microorganismos, y utilizadas después, para la clasificación de los mismos. Las primeras tinciones fueron monocromáticas, a base de colorantes individuales, tales como el azul de metileno, el azul de algodón, etc., y no fue sino hasta que Gramdescribió su técnica tintorial, cuando se comenzaron a utilizar las técnicas policromáticas o con colorantes de contraste. Las tinciones que generalmente se utilizan en microbiología, y que clasifican prácticamente al 90% de las bacterias de importancia clínica, son dos: la de Gram y la de Ziehl-Neelsen.

TINCION DE GRAM

Esta tinción es la más utilizada en microbiología; se basa en lacapacidad de la pared bacteriana para resistir la decoloración por alcohol acetona. Clasifica la mayoría de las bacterias en grampositivas y negativas.

EXPLIQUE BREVEMENTE LA DIFERENCIA ESTRUCTURAL DE LA PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAMPOSITIVAS CON RESPECTO A LAS GRAMNEGATIVAS:
La mayor diferencia entre las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas es la estructura de la paredcelular. La pared celular de las bacterias Gram-positivas tiene dos componentes principales, peptidoglicano y ácido teicoico. También hay polisacáridos y proteínas adicionales que varían de acuerdo a la especie. El exterior de la pared celular es espesa y compuesta principalmente de mureina, un peptidoglicano encontrado solamente en los prokariotes. La superficie interior de esta pared celular toca lamembrana celular, una capa doble de lípidos. La pared celular de las Gram-positivas tiene un contenido bajo de lípidos, no contiene endotoxinas, no contiene espacio periplasmico, y no contiene canales de porinas.
Las bacterias Gram-negativas tienen tres capas en su pared celular, sin tomar en cuenta el espacio periplasmico. Como las bacteria Gram-positivas, ellas están rodeadas por una membranacelular, pero la capa de peptidoglicano es delgada y no esta en contacto directo con la membrana celular. Adicionalmente, la capa de peptidoglicano no contiene ácido teicoico, aunque si contiene una lipoproteína de mureina que enlaza esta delgada capa con la única membrana celular exterior. Esta parte exterior de la membrana celular es compuesta de una capa doble de fosfolipidos que contienelipopolisacaridas (LPS). LPS es el componente de la pared celular que contiene Lípido A, o endotoxina. También únicas al componente exterior de la membrana de las Gram-negativas, son las proteínas porinas que permiten el paso de nutrientes.

Preparación de extendidos (frotis)
El profesor proporcionará una muestra para realizar la preparación. Con una asa bacteriológica o con un hisopo(dependiendo de la muestra), se tomará una porción pequeña, la cual se extenderá sobre un portaobjetos que se dejará secar a temperatura ambiente. Una vez que la preparación se seque, se procederá a la fijación que tiene por objeto evitar que los lavados desprendan la muestra; esto se logra calentando la laminilla brevemente en el mechero o colocando una gota de metanol sobre la muestra.

Materialnecesario

• Portaobjetos con material extendido para la tinción
• Asas bacteriológicas
• Cristal violeta
• Lugol de Gram
• Alcohol acetona
• Safranina
• Metanol
• Agua
• Microscopio óptico

Método

1. Cubrir el frotis con cristal violeta por un minuto. Lavar (todos los lavados son con agua corriente)
2. Cubrir con lugol (sirve de mordiente o fijador del colorante) para Gram porun minuto. Lavar.
3. Decolorar con alcohol acetona hasta que sólo las partes más gruesas del frotis tengan color. Lavar rápidamente para evitar que la muestra se decolore demasiado
4. Cubrir con safranina por 30 segundos. Lavar y dejar secar a temperatura ambiente, o bien, hacerlo cuidadosamente y sin tallar con un papel secante.
El orden violeta, lugol, alcohol y safranina se recuerda...