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Práctica 3
Métodos de caracterización de proteínas:
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Objetivo: Que el estudiante se familiarice con algunas técnicas actuales
de caracterización de proteínas.

Fundamento de la electroforesis.
La electroforesis se define como el movimiento de partículas cargadas en
un campo eléctrico. La movilidad de las partículas está determinada de formaproporcional al voltaje aplicado y la carga neta de la molécula y de forma
inversamente proporcional a la fricción de la molécula; esta última depende de la
forma y el tamaño de la misma. La relación entre estas variables está
representada en la ecuación 1:
Movilidad de la molécula= (voltaje aplicado)(carga neta de la molécula)
Fricción de la molécula (forma y tamaño)

ecuación 1

Durante unaelectroforesis el voltaje se mantiene constante por lo que la
movilidad de la molécula dependerá de su carga, forma y tamaño: a mayor carga
neta, la molécula migrará más rápido; a su vez, a mayor fricción, la movilidad
será menor.
La electroforesis se utiliza en bioquímica como un método de separación de
proteínas analítico más que preparativo, es decir, es un método útil para la
visualizacióny separación de preparaciones de proteínas en pequeña escala y
no a gran escala. Tiene la ventaja de que ayuda al analista a determinar
rápidamente cuántas proteínas existen en una preparación en particular o el
grado de pureza de una preparación proteica específica. Además, la
electroforesis permite la determinación experimental de propiedades como el
punto isoeléctrico y el peso molecular(PM) de una proteína. La electroforesis de
proteínas se realiza generalmente sobre matrices tipo gel, la más común es la
poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida poseen propiedades tales como
transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran
variedad de compuestos químicos que los hace un excelente medio de soporte
para separaciones electroforéticas. Los gelesde poliacrilamida son el resultado
de la polimerzación del monómero acrilamida y la bis-acrilamida (N N’-metil-bisacrilamida) en presencia de persulfato de amonio y la tetrametiletiléndiamina
(TEMED). El persulfato de amonio activa al TEMED, el cual a su vez activa al
monómero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son
entrecruzadas al azar por la bis-acrilamida,formándose así una red de porosidad
uniforme. Varias modificaciones pueden realizarse para obtener geles con
características específicas según sea necesario. Si se requieren geles con poros
grandes, se puede disminuir la cantidad de acrilamida y/o bis-acrilamida en la
reacción de polimerización y viceversa. El tamaño del poro de la matriz de

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poliacrilamida a utilizar dependerá de lasdiferencias en tamaño de los
componentes proteicos que se desean separar. Por ejemplo, si usted desea
separar dos proteínas pequeñas, con pesos moleculares de 7 kDa y 8 KDa, se
necesita un gel de poro pequeño, el cual se obtiene con una concentración de
acrilamida de entre el 15 al 20%. Este gel, sin embargo, no sería útil para
separar proteínas de alto PM, del rango de más de 100 kDa. Para ello,se
necesitaría un gel de entre el 7.5 al 10% de acrilamida. En la sección “Reactivos”
se encuentra un cuadro con las cantidades necesarias para preparar un gel de
poliacrilamida al 12%.
Posiblemente, el método electroforético en geles de poliacrilamida (PAGE por
sus siglas del inglés, “Polyacrylamide gel electrophoresis”) más comúnmente
utilizado para la determinación de pureza de unamuestra o del PM de una
proteína es el PAGE en presencia del detergente aniónico duodecilsulfato de
sodio (SDS) o SDS-PAGE. La muestra a ser analizada es tratada previamente
con un agente reductor, como el 2-mercaptoetanol y con SDS en presencia de
calor. El 2-mercaptoetanol reduce los posibles puentes disulfuro que las
proteínas de la muestra tengan y el SDS, un agente desnaturalizante se une...