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INTRODUCCIÓN:

La electroforesis es el movimiento de partículas cargadas al ser sometidas a un campo eléctrico. Los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a sus grupos fosfatos. Por lo tanto, en una electroforesis migrarán al ánodo (polo positivo). Cuando las moléculas de DNA se desplazan a través deuna matriz porosa son sometidas a dos fuerzas de acción opuestas que van a determinar la velocidad a la que la partícula migrará. Dichas fuerzas son:
-Fuerza eléctrica: es la fuerza que atrae a la partícula al electrodo, su intensidad es directamenteproporcional a la carga y les impone una aceleración directamente proporcional al cociente carga/ masa
-Fuerza de rozamiento: que al contrario de la anterior, se opone a la migración, la intensidad de dicha fuerza depende de la forma y el tamañoy de las características del medio.
La electroforesis se utiliza para separar macromoléculas en solución, esta separación puede analizarse desde el punto de vista analítico (sólo para verlas) o preparativo (para purificarlas). La aceleraciónimpuesta por la fuerza eléctrica es igual para cualquier ácido nucleico esto se debe a que estas moléculas tienen un fosfato cargado negativamente por cada nucleótido y a que sus cuatro nucleótidos tienen un peso molecular similar por lo cual la relación carga/ masa es independiente de la secuencia y tamaño de la molécula. Las diferencias de velocidad entonces van a estar dadas por la intensidadde la fuerza de rozamiento, es decir, por su forma y tamaño.
Para lograr una separación eficiente, se utiliza un medio soporte que aumente la fricción recibida por las macromoléculas y reduzca la difusión al mínimo. Este medio suele ser una red molecular de algún polímero orgánico (gel). Las mezclas de DNAs de distinto tamaño se hacen migrar a través del gel por un determinado tiempo obteniéndoseuna separación en la que la distancia migrada por una molécula es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular(o de su longitud en pares de bases). Cuando se realiza un análisis electroforético de muestras de ácidos nucleicos que no poseen la mima forma, es necesario, para determinara su peso molecular, homogeneizar su estructura. Para esto se utilizan agentes desnaturalizantesfuertes que destruyan la estructura secundaria.
Concentración de agarosa y rango de resolución:
Regulando el porcentaje de agarosa se puede regular el tamaño del poro. A mayor porcentaje, poro más chico, la ventaja de que el poro sea más chico es que se podrán observar diferencias de pocas bases en los fragmentos más pequeños. Al contrario, a menor porcentaje, poro más grande, en este caso, si bientodos los fragmentos chicos correrán rápidamente (razón por la cual no se podrán percibir diferencias de pocas bases en estos fragmentos) se podrán resolver mejor los fragmentos de mayor peso molecular.
Topoisómeros:
Se denomina topoisómeros a distintas formas de la misma molécula. En el caso del DNA plasmídico dentro de la bacteria se encuentra en conformación superenrrollada (Coiled coilcircle o CCC). Si se rompe un enlace fosfodiéster en una de las hebras pueden obtenerse moléculas circulares abiertas (CA) ; si la ruptura se da en las dos hebras de la cadena se obtiene un fragmento lineal (L). Si bien las tres isoformas tienen el mismo tamaño, su forma es distinta por lo cual cambia su migración. En general, la forma superenrrollada migra más rápidamente que la lineal, y está a...