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Transformación de Escherichia coli con DNA plasmídico.
Introducción:
Las bacterias poseen 3 mecanismos de intercambio de material genético (ya que carecen de reproducción sexuada) entre individuos de la misma especie y, en ciertos casos, entre distintas especies. Dichos mecanismos son conjugación, transducción y transformación. La conjugación y transducción están explicadas en la guía de Tps,nosotras haremos hincapié en la transformación, ya que ésta es la que realizamos en el laboratorio.
La transformación es la adquisición de DNA desnudo del medio extracelular por una célula bacteriana (que se denomina “competente”). Este estado de competencia es transitorio y generalmente se debe a un crecimiento rápido o a falta de nutrientes. Cuando ingresa a la célula puede ocurrir que el DNAse degrade o se puede incorporar al cromosoma bacteriano por recombinación y si el DNA es un plásmido incluso puede quedar como un elemento replicativo autónomo dentro de la célula. Este mecanismo que acabamos de explicar es natural y requiere la expresión de una compleja maquinaria celular. A diferencia de este proceso que es natural, en la transformación en el laboratorio la competencia encélulas bacterianas es inducida para la introducción de plásmidos (no es un estado natural de la célula). Estas bacterias fueron previamente crecidas en un medio de cultivo con LB líquido, colectadas durante la fase “log” y tratadas con CaCl2 para neutralizar las cargas negativas de los fosfatos del DNA y de los fosfolípidos de la membrana bacteriana para disminuir la repulsión natural entre las cargasy así facilitar el ingreso del DNA plasmídico a la célula( se resuspendieron en una solución fría que contenía este compuesto).Se utilizaron cepas del laboratorio de Escherichia coli previamente tratadas como se explicó y el DNA plasmídico que extrajimos en el TP1.También realizamos un control negativo, uno positivo y uno de viabilidad que serán explicados a lo largo del trabajo práctico.
Esimportante recordar que los plásmidos utilizados tienen un origen de replicación de alto número de copias y el gen de la -lactamasa, una enzima que degrada ampicilina para así poder lograr que sólo crezcan las bacterias que contienen al plásmido, ya que las bacterias de E. coli no tienen esta enzima y no resisten la ampicilina (que va a estar en nuestro medio de cultivo).
El objetivo deltrabajo es transformar E. coli con el plásmido que purificamos en el TP1 y calcular la eficiencia de una preparación de células competentes.
Desarrollo:
Recibimos 3 tubos eppendorf con 50 microlitros de bacterias competentes en hielo y los numeramos del 1 al 3. Al tubo 1 le agregamos 2 microlitros de agua estéril (control negativo), ya que al agregarle agua estéril, las bacterias no van a resistir laampicilina por lo que en la caja de petri no esperamos ver nada la clase siguiente), al tubo 2 le agregamos 2 microlitros de nuestro plásmido diluido 1/100 y al tubo 3 le agregamos 2 microlitros de plásmido control preparado por los docentes (este tubo es nuestro control positivo). Ya que las bacterias competentes tenían sus membranas alteradas las tuvimos que manipular cuidadosamente y paraevitar contaminación todos los pasos realizados se realizaron cerca de un mechero encendido y con las manos limpias en alcohol.
Dejamos los 3 tubos 20 minutos en hielo y luego los colocamos rápidamente del hielo a un baño a 42° durante 1 minuto y medio para que se produzca un shock térmico. Este paso se realiza para que el DNA plasmídico ingrese a las células ya que la combinación de Ca2+ y latemperatura hacen que se formen poros en las membranas plasmáticas bacterianas. Luego pusimos los 3 tubos nuevamente en hielo durante 5 minutos para enfriarlos rápidamente (no se pork!!) y pasados los 5 minutos le agregamos 950 microlitros de LB líquido (sin ampicilina), homogeneizando por inversión y los colocamos en un baño a 37° durante 30 minutos. Este paso lo realizamos como un medio de...