Tp 4 biologia

TP Nº4
Actividad enzimática de la α-amilasa

Introducción
Las enzimas actúan como catalizadores de las reacciones químicas de los sistemas biológicos. Son necesarias en los seres vivos ya que muchas de las reacciones que catalizan tienden a ser lentas en condiciones fisiológicas, las enzimas proporcionan un ambiente tridimensional favorable donde puede llevarse a cabo la reacción. Algunasenzimas además pueden necesitar para llevar a cabo su función cofactores que pueden ser iones inorgánicos, complejos orgánicos, coenzimas o grupos prostéticos
Al analizar una enzima es importante definir las condiciones ambientales en las cuales la actividad de esta es óptima, y también determinar su estructura y composición química y los mecanismos de inhibición o activación que pueden actuar sobreella. Aportar esta información sobre una determinada enzima se denomina caracterizar su actividad enzimática.
En este trabajo se caracteriza la actividad de la enzima α–amilasa, encargada de degradar el almidón liberando como productos oligosacáridos compuestos por pocas unidades de glucosa, llamadas dextrinas.

Objetivos
Estudiar la actividad enzimática de la α –amilasa de la saliva humana,estudiando su variación al modificar de a uno por vez los distintos factores del medio o realizando sobre la enzima distintos pretratamientos.

Metodología
Se recolecta la enzima de una muestra de saliva humana y se diluye hasta encontrar una dilución óptima: dilución a la cual la enzima degrada la totalidad del sustrato en un tiempo entre 3 y 8 minutos. Este tiempo es llamado tiempo dereferencia.
Para detectar la desaparición del sustrato se lleva a cabo la reacción en una solución de Lugol, que es una solución 1% I2 en equilibrio con KI 2% en agua destilada. Se utiliza esta solución para poder realizar un test colorimétrico basado en que el almidón en presencia de una solución de iodo presenta una coloración azulada debido a la interacción física entre el iodo y las moléculas deamilosa. Es posible afirmar que el sustrato ha desaparecido cuando deja de presentarse esta coloración, ya que la enzima ha degradado el sustrato y este ya no puede interactuar con el iodo, desapareciendo el color azul de la solución, este efecto es conocido como “efecto acromático”.

Luego de realizar esto, se realizaron distintas experiencias para caracterizar y entender la naturaleza de la αamilasa. Para lograr esto fue necesario separar las experiencias en dos grupos: pretratamientos y tratamientos.




✓ Pretratamientos:
Estos se realizaron con el objetivo de averiguar cuál es la naturaleza de la α amilasa, o sea, saber qué tipo de molécula es (proteína, RNA, molécula inorgánica, etc.)
Para poder averiguarlo primero se calentó la solución a 100°C, ya que ungran grupo de enzimas no pierde su actividad con el calor, como si lo hacen por ejemplo las proteínas que se desnaturalizan. Luego de esto se realizó la experiencia anterior de nuevo pero con la enzima pretratada con calor.
El segundo pretratamiento consistió en el agregado de proteasa k, antes de realizar la experiencia con almidón. Si la enzima fuese de naturaleza proteica, necesariamente,la actividad debería bajar y el efecto acromático se observaría en un tiempo mayor o directamente no sería observado.

✓ Tratamientos:
El objetivo de estos, es caracterizar y observar las condiciones en las que nuestra enzima, tiene una actividad óptima.
Para hacerlo se utilizó la enzima a distintos pH, a distintas temperaturas y a una concentración de sales distinta. Lo esperable, esque a temperaturas y pHs cercanos a los del cuerpo humano y a una concentración similar a la fisiológica de sales, la enzima tuviese su actividad óptima. Por esto se hicieron las experiencias en las siguientes condiciones:

Temperatura:

-T=0°C
-T=ambiente
-T=70°C


pH:

-pH=2
-pH=12

Sales:

-[NaCl]=0,1M



Dadas estas condiciones se observó el tiempo en el que se producía el...