TP 5 Y 6 Qca Biooloooooogica 1

Desarrollo:

Se realizo el cultivo de Escherichia coli en medio liquido LB durante toda la noche a 37°C. Este paso se realizó para obtener el gen que codifica para PchP, con una enzima de restricción BamHI. Esta enzima cortó el plásmido en la parte donde se encontraba ese gen.
Luego de esto se tomo 1,5 ml del cultivo y se coloco en un tubo eppendorf (esto fue realizado por las profesoraspreviamente al trabajo). Se centrifugo durante 5 min a 8000rpm y se descarto el sobrenadante para obtener el precipitado de Escherichia coli.
Este precipitado de bacterias se resuspendió en 200 ul de solución I y a esto se le agrego 5 ul de ARNasa, en el caso de ADN plasmídico (procedimiento que en ADN genómico no se aplicó), la cual es una enzima que se encarga de romper el ARN.
En caso de ADNgenómico, se agregó SDS se homogenizó y se dejo reposar 3 min a temperatura ambiente. En el ADN plasmídico se realizó el mismo procedimiento, solo que se le agregó NaOH que tiene como función aumentar el pH provocando la lisis celular. Pasado los 3min se agregó la solución III (AcK 3M Ph 4,8) se mezclo por inversión. El AcK es una sal que produce precipitación de las proteínas citoplasmáticas.
En elcaso del ADN plasmídico, se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos y se conservó el sobrenadante que contiene el ADN plasmídico y se descarto el precipitado que contenía el AND genómico y las proteínas.
En caso del ADN genómico, se dejó reposar 40 minutos en hielo, luego de mezclarlo por inversión. Se lo centrifugó a 10000 rpm durante 10 minutos. Se agregó isopropanol frío, que tiene comofunción extraer la capa de solvatación de los Ac. Nucléicos, permitiendo así su precipitación y purificación. Se agitó y se dejo 5 minutos a temperatura ambiente. Se volvió a centrifugar, esta vez durante 10 minutos, descartándose el sobrenadante. Luego se lavó el precipitado, agregando 500 ul de Etanol 70%, para purificar el ADN y eliminar cualquier resto de proteínas que puede haber quedado. Secentrifugo a 12.000 rpm durante 5 min y se descartó el sobrenadante. Se dejo evaporar el etanol en estufa hasta que el precipitado se volvió transparente (aprox 2hs). Se resuspendió el precipitado en 30 ul de agua destilada (estos últimos dos pasos fueron realizados por la profesora).
Esta serie de pasos fueron realizados para la obtención de ADN y ARN genómico y ADN plasmídico.


En la parte dos delpráctico se realizaron los siguientes pasos:
Corte del plásmido con endonucleasas de restricción:
1- Se coloco en un tubo de eppendorf el mix de reacción para obtener un fragmento de ADN plasmídico utilizando enzimas de restricción.
ADN plasmídico : 10 ul
Enzima de restricción BamHI : 1 ul
Buffer BamHI : 2 ul
H20: 8 ul
2- Se incubo a 37°C durante 1 hs
Electroforesis de ácidos nucléicos:
1- Searmo el soporte para el gel de agarosa y se coloco el peine para formar las calles de siembras, por donde van a difundir los Ac.Nucléicos.
2- Se preparo el gel al 1% de agarosa p/v (azucares que forman una red o malla tridimensional) y se disolvió en buffer TAE 1x pH 8 (posee unos colorantes que van a marcar el frente de corrida, ya que los Ac.Nucléicos son incoloros) Luego de ser homogeneizadoy solidificado se coloco en la cuba de electroforesis.
3- Se vertió en la cuba el buffer de corrida hasta cubrir el gel.
4- Se mezclaron 10 ul de ADN genómico con 3 ul de buffer de carga 6x y por otro lado se mezclaron 5 ul de ADN plasmídico con 2 ul de buffer de carga. Estos se homogeneizaron con la micropipeta cargando y descargando.
Buffer de carga 6X 0,25% de azul de bromofenol (p/v), 0,25%xileno cianol (p/v), rojo ponceau 0,25% (p/v) 30% de glicerol (v/v), se disolvieron en agua destilada. Este buffer contiene además 1 ul de GelGreen (tiñe a los ác. Nucléicos para poder visualizarlos, una vez realizada la corrida) 6 X cada 5ul de ADN. El xileno cianol en la electroforesis se mueve aproximadamente como las moléculas de ADN de 9000pb, el azul de bromofenol como las moléculas de...