tp extraccion dna plasmidico y electroforesis

OBJETIVOS

Conociendo la estructura básica de una célula procariota Gram negativa y las propiedades, composición química y funciones de cada una de sus partes (los plásmidos, en particular) aplicamos la metodología especificada en el trabajo para obtener una muestra de DNA plasmídico de E. coli. Para la segunda parte del trabajo, utilizamos el producto obtenido para familiarizarnos con laelectroforesis en gel de agarosa y aprender a deducir el peso molecular de una molécula de ADN corrida en el gel.


INTRODUCCIÓN

Las bacterias son organismos unicelulares que forman parte del reino celular Procariota. Se las puede clasificar en dos tipos: Gram negativas y Gram positivas. Las primeras y más comunes tienen la característica de poseer una doble membrana celular rodeando la pared depéptidoglicano, mientras que las otras tienen una membrana interna y una pared más gruesa, cualidad que les permite captar más una determinada tintura utilizada para diferenciarlas.
La bacteria que utilizamos para nuestros procedimientos era del tipo Gram negativa, de la especie E. Coli, y lo que aislamos fue una parte dentro de toda su estructura extracelular y de membranas: su DNA plasmídico.Los plásmidos son moléculas de DNA circulares más cortas que las cromosómicas que le confieren a la bacteria características adicionales. Se encuentran normalmente en estado superenrrollado en el protoplasma y puede haber más de uno por célula. Cuando sucede eso, es posible que haya una incompatibilidad plasmídica, si es el caso que ambos plásmidos son parecidos en secuencia y demandan losmismos tipos de enzimas para poder replicarse. Es importante destacar que no son esenciales para la vida de la célula, sino que le confieren características que pueden ayudar o no a su supervivencia. Por ejemplo pueden codificar para una proteína particular que le da a la célula resistencia a algún medicamento.

Para la biología molecular, se volvió clave el uso de plásmidos en distintos métodos deingeniería genética con distintas aplicaciones. En primer lugar se los puede usar como “vectores de clonado”, técnica en la que se les incorpora a ciertos plásmidos un inserto de DNA genómico (o cDNA) y luego se los introduce en bacterias para que su maquinarias los reproduzcan. Posteriormente se las cultiva en medio sólido obteniendo muchas colonias proveniente cada una de una única célula conel vector agregado. Como la replicación de los plásmidos no está necesariamente sincronizada con la del DNA genómico, aunque muchas veces sí requiere de la maquinaria replicativa del entorno, puede que más de una célula de la colonia (además de la original) contenga clones del plásmido dentro suyo. También se puede usar a los plásmidos como “vectores de clonado”, en cuyo caso además de agregar elinserto se agrega secuencias reguladoras de expresión para evaluar cómo es regulada en la célula o estudiar las funciones mismas de la proteína expresada.

En este Trabajo Práctico se utilizó como punto de partida un cultivo del plásmido pBluescript II SK/KS, cuyas partes se ven diferenciadas en el diagrama a continuación:

Este plásmido tiene una longitud de menos de 3 kpb y un origen dereplicación, rep(pMB1), de alto número de copias, lo que quiere decir que la maquinaria replicativa se activa seguido originando que por célula hayan entre 20 y 200 plásmidos idénticos. El gen bla (ApR) codifica para una enzima que degrada Ampicilina, confiriéndole a la bacteria resistencia a dicho antibiótico. El fragmento F1 es un origen de replicación adicional especial para virus, a partir del cualéstos obtienen DNA simple cadena.
El sitio MCS (marcado en verde) o Multiple Cloning Site representa una secuencia que es reconocida por enzimas de restricción. Rodeando al sitio anterior hay dos secuencias de promotores PT3 y PT7 tomadas de los fagos T3 y T7, que funcionan dirigiendo la transcripción en sentidos opuestos de manera excluyente (no transcribe en ambos sentidos simultáneamente....