Tp1-2 Ibmc

Objetivos
* Purificar DNA plasmídico (pBluescript II Sk/ks) de Escherichia Coli (pH5 alfa)
* Verificar si fue exitosa la purificación de DNAp extraído de E. Coli

Introducción
Los plásmidos son moléculas circulares extra cromosómicas de DNA doble cadena presentes en bacterias y en algunas células eucariotas (ej levaduras y plantas). En las bacterias se encuentran en forma superenrollada ysu tamaño puede variar desde pocos miles de pares de base (pb) hasta más de 100 kpb.
Los plásmidos no son esenciales para la supervivencia de las bacterias: pueden contener genes que le otorguen características especiales, permitiéndoles sobrevivir en medios desfavorables y competir con otros microorganismos.
Por ejemplo:
-Resistencia a antibióticos
-Producción de toxinas, factores depenetración en tejidos, adherencia a tejidos del hospedador
-Utilización de determinados azucares (lactosa por ej)
Los plásmidos bacterianos tienen un origen de replicación y se duplican de modo autónomo, aunque su replicación depende de factores del hospedador para llevarse a cabo (DNA polimerasa III y I). Durante la división celular, las moléculas de DNAp segregan al azar a cada célula hija: estoprovoca que el plásmido pueda perderse de la población a lo largo de sucesivas generaciones si no existe una presión de selección que fuerce su mantenimiento.
El número de copias por célula de un plásmido determinado es REGULADO (este modelo de regulación se encuentra codificado por el DNAp)
Existen tres clases de plásmidos en cuando al n° de copias:
-Plásmidos con bajo número de copias (1-5 porcélula)
-Plásmidos con mediano número de copias (15-20 por célula)
-Plásmidos con ALTO número de copias
DESARROLLO 1era PARTE
Para la realización del TP1 se utilizaran las siguientes herramientas de laboratorio, asi como soluciones fundamentales para la lisis alcalina.
* Se utilizará como material de partida un cultivo de bacterias Escherichia Coli conteniendo el plásmidopBluescript II de alto número de copias. Esto permite la purificación de una gran cantidad de DNAp a partir de poca cantidad de bacterias.
* Solución 1: Solución de resuspensión (Tri-HCl 50 nM, EDTA 10 nM PHS) su principal función es resuspender las bacterias para que entre en contacto con la solución de lisis (sol.2). Esta solución es hipotónica, por lo cual el agua tiende a ingresar a labacteria y la presión resultante genera inestabilidad en la pared de la misma.
* Solución 2: Solución de lisis alcalina (NaOH 200 nM, SDS 1%). Esta solución lisa las bactieras: se produce la ruptura d ela pared celular de peptidoglicano, la solubilización de las membranas externas e internas, degradación PARCIAL del RNA, y lo más importante, la DESNATULIZACIÓN DEL DNA GENÓMICO Y PLASMÍDICO. Hay quetener en cuenta que el DNA genómico debido a su gran tamaño se fragmenta durante la lisis, por lo tanto al desnaturalizarse sus hebras, estas se SEPARAN. Por su lado el DNA plasmídico se desnaturaliza, pero al ser más pequeño no se fragmenta (mantiene el superenrollamiento, las hebras desnaturalizadas siguen físicamente vinculados).
* Solución 3: Solución de renaturalización (K+AcO 3M, PH 4.8)Con esta solución, se renaturaliza el DNAp, y se separa del DNA g.
* Isopropanol
* Etanol 70%

Herramientas de laboratorio: tubos eppendorf, tres pipetas automáticas (1000, 200 y 20 ul), tips y recipiente con hielo (para mantener algunas soluciones).
1) Cada grupo recibirá un tubo eppendorf conteniendo un pellet correspondiente a 1.5 ml de cultivo bacteriano de E.Coli conteniendo unplásmido, resuspendido en 0.3 ml de la solución 1. Llamaremos #1 a este tubo eppendorf.
A continuación se le agrega 0.3 ml de Solución 2, y es mezclado por inversión dando un volumen final de 0,6 ml. Se lo deja incubar durante 5 min para que la lisis se realice efectivamente. Pasado este tiempo, se puede observar que la muestra pasó de ser turbia a transparente y viscosa.
2) Al tubo #1 le es...