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Trabajo práctico Nº 5

Inducción enzimática

Objetivo

Reconstruir, en base a los resultados que se obtengan de los experimentos, el mecanismo de regulación del operón lactosa por control positivo y negativo.

Introducción

Llamamos control de la expresión génica al mecanismo de regulación que les permite a los organismos aprovechar los recursos disponibles del medio en un determinadomomento.
En las bacterias, organismos unicelulares, existe un mecanismo que regula determinados genes estructurales que codifican para tres proteínas, dos involucradas en la obtención de energía mediante las moléculas de lactosa, al que se denomina Operón lactosa. Un Operón es un conjunto polisistrónico de genes estructurales cuya expresión está regulada por los mismos elementos de control(promotor y operador) y el gen regulador.
Los principales elementos que constituyen el operón son:
• El gen z+: codifica para la β -galactosidasa que cataliza la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa.
• El gen y+: codifica para la galactósido permeasa una proteína “Carrier” de la membrana bacteriana que permite la entrada de lactosa.
• El gen a+: codifica para la tiogalactósidotransacetilasa que cataliza la transferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de un aceptor tiogalatósido. Este gen no está relacionado con el metabolismo de la lactosa.
• El promotor (P): se trata de un elemento de control. Es una región del ADN con secuencia reconocida por la ARN polimerasa para comenzar la transcripción. Se encuentra río arriba de los genes estructurales.• El operador (O): se trata de otro elemento de control que es una región del ADN reconocida por un sitio activo de unión al ADN de la proteína represora. El operador se sitúa entre la región promotora y los genes estructurales.
• El gen regulador Lac I (i): secuencia de ADN que codifica para la proteína reguladora que reconoce la secuencia de la región del operador. El gen regulador estácerca de los genes estructurales del operón pero no forma parte de él.
• Proteína represora: proteína codificada por el gen regulador que se une al operador e inhibe la transcripción dado que la RNA pol no puede avanzar en presencia de dicha proteína; es decir que la secuencia operador regula al promotor.
• Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresión de los genes.Control positivo: llamamos control positivo al tipo de control ejercido por una molécula a la que se denomina activador, en este caso es la proteína CRP que tiene un sitio de unión a un cofactor, el AMP cíclico, y otro de unión al DNA. Cuando se forma el complejo CRP- AMPc se unen a un sitio del promotor del operón haciendo más estable la unión de la ARN polimerasa a este.
Control negativo: sedice que un sistema está bajo control negativo cuando el producto del gen regulador reprime o impide la expresión de los genes, actuando como un represor.

PROCEDIMIENTO

Primera parte del experimento: (in vivo)

Se realizó la incubación de la cepa de E. coli con distintas soluciones para observar luego, en los resultados, los efectos de éstas en el mecanismo de regulación del operón lactosa.Nota: la cepa de E. coli utilizada fue incubada la noche previa a la realización del TP en un cultivo denominado “semilla”; se utilizaron otras fuentes de carbono distintas de glicerol.
Se colocó 0.1 ml del cultivo en 8 tubos eppendorf (excluyendo el tubo Nº 8)y se le realizaron los siguientes tratamientos:

|Tubo Nº |1 |2 |3 |4|5 |6 |7 |8 |9 |
|Cultivo |0.1ml |0.1ml |0.1ml |0.1ml |0.1ml |0.1ml |0.1ml |- |0.1ml |
|Sc. Fisiológica |0.5ml |0.4ml |0.4ml |0.4ml |0.4ml |0.3ml |0.2ml...