tp6 inducción enzimática

UNIVERSIDAD DE BUENO AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
INTRODUCCION A LA BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR
INFORME DEL TRABAJO PRACTICO N° 6

Inducción enzimática

Introducción
Tanto los organismos eucariotas como procariotas poseen mecanismos de control de la expresión génica que les permite ahorrar energía evitando la síntesis de productos no requeridos.
Uno de los mecanismosmás conocidos en bacterias es el Operón Lactosa, el cual regula la expresión de genes necesarios para el metabolismo de la lactosa como fuente de energía.
Este consiste en un grupo de tres genes estructurales conectados llamados Lac Y, Lac Z y Lac A, los cuales comparten el promotor. Cada uno codifica, respectivamente, para distintas enzimas: galactósido-permeasa (permite el ingreso de lactosaa la célula), β-galatosidasa (hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa) y tiogalactósido-transacetilasa (su función parece no estar relacionada con el metabolismo de la lactosa).
En otra región del DNA bacteriano, se encentra un gen llamado Lac I, el cual codifica para una proteína que actúa como represor de la transcripción de los genes, ubicándose en una región entre el promotor y el gen LacZ, llamado operador. Esta represión, conocida como control negativo, ocurre en ausencia de lactosa. En cambio, cuando hay lactosa en el medio, esta actúa como inductor al interactuar físicamente con el represor y despegarlo del operador, permitiendo que la ARN polimerasa transcriba.
Por último, existe una proteína llamada CRP que en presencia del ligando AMPc , se une al promotor haciéndolo másafín a la RNA Pol. A la CRP se la denomina activador y ejerce un control positivo.

Objetivos
La finalidad de este trabajo es estudiar la inducción del Operón Lactosa bajo distintas condiciones.


Materiales y métodos
Para los materiales y procedimientos se siguió con lo indicado en la guía de TP Nº6 de I.B.M.C., primer cuatrimestre, 2014.
En la primer parte “in vivo” del experimento, seprepararon en 8 tubos eppendorf distintas soluciones, en los cuales, exceptuando el tubo 7 se le agrego un cultivo de E. Coli. Para finalizar esta primer parte se lisan las bacterias con SDS y cloroformo, excepto las del tubo 4.
En la segunda parte se agrega ONPG (sustrato sintético) el cual permite revelar la actividad enzimática por medio de su degradación y aparición de un producto coloreado.Se agregó Na2CO3 para detener la reacción.



Resultados

Histograma de barras con valores numéricos relativos de intensidad de color de cada tubo.


Discusión y conclusión
En los tubos 2 y 3 se obtuvo color amarillo, que representa la formación de orto-nitrofenol (producto de la hidrólisis de ONPG), mientras que en el resto de los tubos no se observó color.
La diferencia de color entrelos tubos 2 y 3 está dada porque el IPTG (inductor gratuito análogo estructural de la lactosa) presente en el tubo 2 al no ser hidrolizado por la β-Galactosidasa y ser más afín al represor que la lactosa, hace que el represor no este pegado al operador entonces los genes son transcriptos y traducidos. En cambio, como la lactosa no es tan afín al represor, las concentraciones de β-Galactosidasa quedegradan ONPG, son menores que en presencia de IPTG.
En el tubo 1 la causa de que no haya color es la ausencia del inductor, por lo tanto el represor se encuentra siempre pegado al DNA. Debido a esto, no hay β-Galactosidasa que degrade ONPG y de color.
En el tubo 4 la causa de que no hubiera color fue que las bacterias no se lisaron ya que no se agregó SDS ni cloroformo, por lo cual laβ-Galactosidasa no reacciona con el ONPG debido a que este no puede ingresar a la célula. En cambio, en el tubo 5 las bacterias si fueron lisadas pero les había sido añadido cloranfenicol, el cual, inhibe la traducción. Por ende la β-Galactosidasa no se expresó.
Paralelamente, la falta de color en el tubo 6 se debió a que, al haber glucosa las concentraciones de AMPc son bajas por lo cual el CRP no...