Trabajo enzimologia

Universidad Andrés Bello
Facultad de Ciencias Biológicas.
Laboratorio de Bioquímica.


Trabajo Práctico Nº5 y 6:
“Enzimología.’’

Sección de laboratorio: Bio-267-2
Fecha de realización: 30-09-201107-10-2011
Integrantes: Javier Gomez
Walter Galaz
Eliseo FigueroaNicole Carrasco



-2011-
Introducción.

Las enzimas tienen un gran poder catalítico, y son superiores a los catalizadores sintéticos o inorgánicos. Tienen un elevadogrado de especificad respecto a sus sustratos, aceleran las reacciones químicas específicas y funcionan en soluciones acuosas en temperatura y pH adecuado. Las enzimas se nombran según su función, es decir según las reacciones que catalizan asi existen las Oxidorreductasas, Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas y Ligasas. Dentro de las Hidrolasa se encuentran las fosfatasas que intervienentanto en la formación de de productos metabolicos, como en los procesos de fosforilacion y desfosforilacion con quinasas, y también en procesos de permeabilidad, crecimiento, diferenciación celular, etc.(1)
Las fosfatasas son capaces de hidrolizar los ésteres fosfato de la fosforilcolina y diversos fosfolípidos. Si son activas a un pH inferior a 7 se denominan fosfatasas ácidas, y si son activas aun pH superior a 7 se denominan fosfatasas alcalinas (2)

Uno de los factores que afectan a la velocidad de una reacción catalizada por una enzima es la concentración del sustrato [S], el cual varia en el transcurso de la reacción a medida que el sustrato se transforma en producto, el cual depende de la velocidad inicial V0, llegando a un punto en el cual se incrementa de forma muy pequeña laV0, con el incremento de [S], a este punto se le denomina velocidad máxima Vmax.
La curva que representa la relación que existe entre [S] y V0, tiene la misma forma general para casi todas las enzimas se expresa de una forma matemática con la ecuación de Michaelis-Menten.

Donde V0 es la velocidad inicial. Vmax es la velocidad a la cual la enzima se satura y KM que corresponde a la cantidad desustrato a la cual la velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima.
Para determinar los parámetros cinéticos de KM y Vmax se transforma la ecuación de Michaelis-Menten en la ecuación de doble reciproco, llamada también ecuación de Lineweaver-Burk (3)



Objetivos.

* Determinar el grado de hidrolisis del sustrato p-nitrofenilfosfato determinado por la mediciónespectrofotométrica del p-nitrofenol liberado.
* Determinar el rango lineal de la enzima
* Determinar los parámetros cinéticos de la enzima
Materiales.

Tubos de ensayo | gradilla | Micropipeta p1000 | espectrofotometro |
cubetas | Agua destilada | Micropipeta p100 | Agua destilada |
Espectofotómetro | NaOH 0.02M | Micropipeta p20 | p-nitrofenil fosfato de sodio NPP 2.5nM |
Baño termoregulado a37ºC | Buffer citrato-EDTA pH 5 | p-nitrofenol en NaOH 0.02M | Solución stock de enzima |

Métodos.

Se comenzó el práctico realizando la curva de calibración para lo cual se prepararon 6 tubos de los cuales el primero fue el blanco, a cada tubo se agregó 0,1,2,3,4,5 de p-nitrofenol 60µM y 6,5,4,3,2,1 ml de NaOH 0.02M, luego se midió su absorbancia y s calcularon los µmoles de p-nitrofenol....