Trabajo labo biologia

Ingeniero en Biotecnología - Laboratorio de Procesos Biotecnológicos

Reporte de la Práctica # 3

Precipitación fraccionada de proteínas utilizando (NH4)2SO4



Monterrey, México. A 27 de febrero de 2012

Objetivo
Determinar la concentración de proteínas y su fraccionamiento a diferentes saturaciones de (NH4)2SO4 por medio del método de precipitación con sales, llamado tambiénsalting-out.

Introducción
La precipitación fraccionada tiene como finalidad separar las distintas fracciones de acuerdo al tamaño de lo péptidos (1). El fraccionamiento de proteínas por medio del salting-out es frecuentemente utilizado por ser una forma barata de separar proteínas de un medio acuoso en el que ya están solubles. Sin embargo tiene también sus problemas, la precipitación de lasproteínas es dada en este método por su deshidratación, lo que suele causar un mal plegamiento de éstas y por ello precipiten (2). Es por esto que al recuperarlas hay que darles un tratamiento para volver a plegarlas de manera correcta para algún fin práctico.
Al estar experimentando, éste método debe de ir probando varias concentraciones de saturación de sal diferentes ya que en cada saturación existeun porcentaje de precipitación distinta. Esto varía dependiendo de la proteína y sus interacciones hidrofílicas y/o hidrofóbicas. Se pueden hacer varios pasos de saturación para recuperar la proteína completamente.
En la práctica, la proteína no tiene un diferencial de densidades muy grande (coeficiente de sedimentación), por lo que para acelerar este proceso se hace uso de la centrífuga.
Estatécnica suele ser usada más a nivel laboratorio que industrialmente pues los pasos de adición de sales, sedimentación y extracción de proteína no son fácilmente automatizables.

Materiales y Métodos
Material biológico
Biomasa húmeda de Saccharomyces cerevisiae.

Protocolo experimental
Actividad 1: Precipitación fraccionada con sulfato de amonio
El homogenizado de Saccharomyces cerevisiaese colocó en un tubo cónico para centrifuga de 15mL y se centrifugó a 4000rpm a 10°C por 10min. Se pusieron 10 mL del sobrenadante en otro tubo (tubo 1) de 15mL para centrifugar y se le agregaron 4gr de (NH4)2SO4, se agitó por 2min y se dejó reposar por 5min. Posteriormente se centrifugó el tubo 1 a 4000rpm por 5min, de los cuales se transfirieron 10mL del sobrenadante resultante a otro tubocónico (tubo 2) para centrifugar y se le añadieron 2.8gr de (NH4)2SO4. El precipitado fue resuspendido en solución de Tween 20 5% v/v en buffer K2HPO4 25 mM pH 7, se agitó por 2 min y se dejó reposar nuevamente por 5 min. Se volvió a centrifugar el sobrenadante con (NH4)2SO4 a 4000rpm por 5 min. Se colocaron 0.25mL del sobrenadante obtenido en una celda para espectrofotómetro, se añadió 1mL de reactivode Biuret, se agitó y se dejó reposar 15min, se midió la absorbancia a 540nm. El mismo procedimiento para medir absorbancias se realizó para los dos precipitados resuspendidos en buffer K2HPO4, y para el homogenizado resultante de la primera centrifugación, como blanco se utilizaron 250 µL de buffer con 1mL de reactivo de Biuret. A continuación se muestra una tabla con las cantidades ysaturaciones utilizadas.

Tubo No. | (NH4)2SO4 (% SAT) | Total (gr) (NH4)2SO4 | (NH4)2SO4 Añadir (gr) | Vol (ml) |
1 | 50 | 4.0 | 4.0 | ~12 |
2 | 80 | 6.8 | 2.8 | ~13 |
Tabla 2. Cantidad necesaria de (NH4)2SO4 para alcanzar los niveles de saturación

Equipo utilizado
•Balanza (ARA520, Ohaus Adventurer.
•Potenciómetro (Orion 3 Star, Thermo Electron Corporation).
•Sonicador (Sonifier 150,Branson)).
•Espectrofotómetro (Genesys10UV Scanning, Thermo Scientific)
•Centrífuga (5702R, Eppendorf)

Resultados y Discusión
Actividad 1: Precipitación fraccionada con sulfato de amonio.
Debido probablemente a un error experimental, los resultados indican que la mayor parte de la proteína recuperada se encontraba en el sobrenadante (solución) de la última precipitación (80% SAT) ya que el...