TRABAJO PRACTICO N 6 IBMC

TRABAJO PRÁCTICO Nº6 
INDUCCIÓN ENZIMÁTICA 
 
MATERIA:​
 IBMC 2016­06­07  
GRUPO:​
 9 
INTEGRANTES DEL GRUPO​
:   Moiron Camila 
                                                         Iolster Joaquín 
                                                         Martínez Micaela  
TURNO​
: 9 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

INTRODUCCIÓN  Para optimizar el aprovechamiento de los recursos la bacteria posee varios mecanismos. En 
este trabajo se estudia el proceso de regulación del operón lactosa en Escherichia Coli.  
El sistema posee un doble control, uno negativo y uno positivo. El primero, es ejercido por 
un represor, que al unirse al operador le impide a la RNApol transcribir los genes que forman el operón (Z, Y, A). En presencia de lactosa, el represor pierde afinidad por el DNA, ya que se 
adhiere a ella. En ese momento comienza el segundo control, ejercido por el  activador CRP. 
Este se liga al AMPc para luego unirse al DNA en el promotor del mismo, generando así, 
mayor afinidad de la RNApol con el promotor.  Es importante remarcar que la glucosa es un 
inhibidor de la enzima que participa en la formación del AMPc.  En otras palabras, las condiciones necesarias para la inducción del operón lactosa son: la 
presencia de lactosa y de CRP + AMPc .   
La actividad del operón puede medirse con la actividad enzimática producida por la 
β​
­​
galactosidasa degrada el ONPG dando orto­nitrofenol como uno de los productos de la 
hidrólisis, y este, que es de color amarillo, nos permite medir la cantidad de ​
β​
­​
galactosidasa sintetizada, por ende la actividad del operón.  
 
OBJETIVO 
Estudiar las condiciones de inducción del operón lactosa. Reconstruir en base a los 
resultados que se obtengan de los experimentos el mecanismo de regulación del operón por 
control negativo y positivo. 
HIPÓTESIS:​
 po 
● Para la activación del operón es necesaria la presencia de lactosa, pudiéndose activar 
incluso si hay glucosa. 
●El IPTG y la lactosa secuestran al represor por igual, por lo tanto los resultados de la 
actividad enzimática serán iguales para ambos.  
● La síntesis de ​
β​
­​
galactosidasa se puede dar en ausencia de glucosa, aun cuando no 
haya un inductor.  

MATERIALES 
○
○
○
○
○
○

 

1 ml de cultivo de una cepa de E. coli. 
8 tubos eppendorf  
8 tubos de ensayo 
Gradilla 
Baño termoestatizado a 37ºC y 28ºC  
Micropipetas SOLUCIONES  
○
○
○
○
○
○
○
○
○

Solución fisiológica  
IPTG (40mM) 
Cloranfenicol (30 mg/ml) 
Glucosa (10%) 
Buffer Z pH 7 
SDS 0.1%  
Cl3​
CH  
​
ONPG 
Na​
2CO
​ ​
3 5% 
​

 
PROCEDIMIENTO 
➢ Parte I: Incubación de las bacterias con soluciones inductoras o no inductoras del 
operón.  

 
1. Colocar en cada tubo, según:  
Tubo Nº 

1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

Cultivo 

0.1 

0.1 

0.1 

0.1 0.1 

0.1 

­ 

0.1 

Sc. Fisiológica1 ​

0.5 

0.4 

0.4 

0.4 

0.4 

0.3 

0.5 

0.4 

IPTG2 ​

­ 

0.1 

­ 

­ 

­ 

­ 

­ 

­ 

Lactosa3 ​

­ 

­ 

0.1 

0.1 

0.1 

0.1 

0.1 

­ 

Cloranfenicol4​
  

­ 

­ 

­ 

­ 

0.01 

­ 

­ 

­ 

Glucosa5 ​

­ 

­ 

­ 

­ 

­ 

0.1 

­ 

­ Tabla 1. 1, se utilizará para completar volúmenes. 2 y 3, inductores del operón lactosa. 4, inhibidor de la 
traducción. 5,  represión catabólica.  
2​
. ​
Tapar los tubos y mezclar por inversión 3 ó 4 veces.  

3. Colocar los tubos en el baño de 37ºC durante 30 minutos. 
4. Agregar a todos los tubos 0.6 ml  de buffer Z pH 7. Mantiene el pH constante y evita que la 
enzima no se desnaturalice.  
5. Agregar a todos los tubos, con excepción del tubo 4. 1 gota de SDS 0.1% y 4 gotas de Cl​
CH 
3​(Cloroformo). Liza las células dejando la enzima expuesta.  
6. Agitar los tubos durante 10 segundos y agregar 0.1 ml de Lactosa al tubo 8.  

 
➢ Parte II. Comprobación de inducción o no inducción del operón en cada caso a través 
de un ensayo de actividad de ​
β​
­gal.  

 
1. Trasvasar el contenido de los tubos eppendorf a tubos de ensayo.  
2....