trabajo practico


PRACTICA No. 9
AISLAMIENTO DE ADN

INTRODUCCIÓN

Casi todas las células contienen ADN, pero su concentración varía dependiendo del tejido. El tejido linfoide, el bazo y el timo resultan buenas fuentes para obtener ADN. Algunos tejidos contienen actividades altas de las enzimas deoxirribonucleasa, lo cual trae como consecuencia la fragmentación del ADN, en consecuencia para la obtenciónde ADN es aconsejable que el tejido tenga una baja actividad de la enzima y una alta concentración de ADN.

El ADN se desnaturaliza fácilmente y debe trabajarse con cuidado para obtener un buen producto. Debe evitarse la tensión mecánica y condiciones físicas y químicas extremas y deben inhibirse las nucleasas

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1.- Aislar ADN a partir de bazo de cerdo, basadoen las propiedades de la molécula
2.-Realizar y discutir las diferentes etapas para el aislamiento de ADN

MATERIALES Y REACTIVOS

Bazo de Cerdo (ó hígado de rata)
Buffer salino: 0,15 mol/l de NaCl y 0,015 mol/l Citrato de Sodio
Cloruro de Sodio (2 mol/l).
Cloroformo/Alcohol amílico (6:1)
Alcohol absoluto, Éter
Homogenizador

LABORATORIO

1.- Pique en pedazos muy pequeños 1,0 g detejido y homogeneice en 10 ml de buffer salino frío (4-10°C) durante 1 minuto o menos. Centrifugue la suspensión a 5.000 rpm por 5 minutos

2.- Descarte el sobrenadante y resuspenda el sedimento en NaCl 2 mol/l, hasta obtener un volumen total de 2 ml

3.- Descarte el precipitado y el sobrenadante colóquelo en un tubo con 2 ml de agua destilada.

4.- Aparecerá un precipitado fibroso,sacar exceso de agua sobre un papel de filtro.

6.- Disuelva la deoxirribonucleoproteína en 2 ml de NaCl 2 mol/l, agregue un volumen igual de mezcla cloroformo: alcohol amílico y homogenice por 30 segundos.

7.- Centrifugue la emulsión a 5.000 g por 15 minutos, y recoja la capa superior (acuosa). La recolección debe hacerse por succión cuidadosa en forma tal que no se agite la proteínapresente en la interfase de los dos líquidos.

8.- Añada el doble de 2 ml de alcohol frío para precipitar las fibras de ADN.

9. Deje evaporar el éter remanente colocando el ADN en un vidrio de reloj por 10 minutos

13.-Pese el ADN seco y almacene a -10 C en 2ml de buffer salino 0,015 mol/l hasta cuando los necesite.TRABAJO PRÁCTICO No. 10
AISLAMIENTO DE ARN


INTRODUCCIÓN

El ARN al igual que el ADN se obtienen a partir de homogeneizados de tejidos o células con fenol. La concentración saturada de fenol rompe los enlaces de hidrógeno en las macromoléculas, causando desnaturalización de las proteínas. La suspensión turbia se centrifuga y aparecen dos fases, la fase inferior de fenol quecontiene el ADN y la fase superior contiene el ARN. La proteína desnaturalizada se encuentra en ambas fases y puede removerse por centrifugación. El ARN se precipita luego con etanol. El producto obtenido no contiene ADN pero generalmente está contaminado con polisacáridos. Se puede obtener mayor purificación tratando esta preparación con amilasa

MATERIALES

Levadura seca
Solución de fenol (90g/l)
Acetato de potasio (200 g/l, pH= 5)
Etanol Absoluto, Éter etílico
Baño de agua 37 C

LABORATORIO

1.- Suspenda 10 gr de levadura en 40 ml de agua a 37C y espere 15 minutos

2.- Agregue 50 ml de solución concentrada de fenol (altamente corrosivo).

3.- Agite mecánicamente la suspensión durante 30 minutos a temperatura ambiente.

4.- Luego centrifugue en frío a 3000 g durante15 minutos para romper la emulsión.

5.- Con una pipeta Pasteur remueva cuidadosamente la capa superior acuosa y centrifugue a 10.000 g durante 5 minutos en una centrifuga refrigerada para separar la proteína desnaturalizada.

6.-Agregue acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una concentración final de 20 g/l y precipite el ARN añadiendo 2 vol de etanol y Enfríe la solución en...