TRABAJO PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Tema 6. Purificación de proteínas

Bioquímica

TEMA 6. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
1. Introducción
2. Métodos de rotura celular y extracción de proteínas
3. Métodos cromatográficos
4. Métodos electroforéticos

1. Introducción
La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la purificación, al
menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente
un gran esfuerzoya que una célula contiene miles de sustancias diferentes, la
molécula que buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a
concentraciones muy bajas. En este tema se presenta una visión general de las
técnicas más usuales empleadas para la purificación de proteínas, aunque
muchas de ellas son aplicables a la separación de la mayoría de las moléculas
biológicas.
El conocimiento delproteoma, conjunto de proteínas de un organismo, ha
pasado a ser el reto de la comunidad científica y de las empresas
biotecnológicas, una vez que ya se ha completado la secuenciación del
genoma de varios organismos incluyendo el genoma humano. El conocimiento
de las secuencias de DNA que integran nuestros genes no tiene un gran valor,
si no se identifica cual es la función de dichos genes, en su caso,para que
proteínas codifican.
El programa proteoma busca la caracterización de todas las proteínas de la
célula humana, identificando su secuencia de aminoácidos. Cuando se obtenga
toda la secuencia de aminoácidos del proteoma humano se podrá relacionar
mediante potentes programas informáticos la secuencia de aminoácidos de una
proteína con el gen que la codifica. Los métodos de secuenciacióntradicionales
(basados en la degradación de Edman) son demasiado lentos para abordar
esta ingente tarea, la secuenciación de los péptidos debe hacerse por
espectometría de masas. Naturalmente las técnicas de purificación y
aislamiento de proteínas son esenciales para abordar toda esta tarea.
2. Métodos de rotura celular y extracción de proteínas
El primer paso en el aislamiento de una proteína es larotura celular, para
posteriormente poder extraer la proteína con un tampón adecuado. El método
de rotura a elegir depende de las características mecánicas del tejido o células
de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los
distintos métodos ellos están:

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Tema 6. Purificación de proteínas

Bioquímica

z Lisis celular. Válido para células sin pared celular como lascélulas de
tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.
Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que
el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de
la célula, causando su hinchamiento y rotura.
z Destrucción mécanica. Entre estos métodos se encuentran la
homogenización (hacer pasar las célulasentre un tubo y un pistón de vidrio
que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina;
molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las células
a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la sonicación (someter las
células a vibraciones de ultrasonido).

Sonicación
Presión

z Congelación-descongelación. La rotura se produce al someter las células a
uncambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 ºC (con
nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 ºC).

Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan
tampones de extracción para solubilizar las proteínas. Pueden utilizarse como
tales disoluciones acuosas de tampones específicos para proteínas solubles o
bien que contengan ademásdetergentes si se pretende purificar proteínas
asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no
se desnaturalice.
Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a
muchos agentes que pueden dañarla. Los cambios bruscos de pH, ácidos y
bases fuertes, temperaturas extremas y la acción de las proteasas (enzimas
que hidrolizan los enlaces...