Trabajos

Extracción de DNA total de los aislados.- El DNA de los aislados fue obtenido a partir de protoplastos de las levaduras. Lascepas fueron cultivadas en 5 ml de medio YM líquido a 22°C hasta saturación, luego colectadas mediante centrifugación a 7000 rpmy resuspendidas en 500 μl de KCl 0,8 M y se agregó 100 μl de glucanex a 5 mg/ml o 35 μl de zymoliasa 100T a 2 mg/ml. La mezclafue incubada por 2 horas a 37°C centrifugando luego a 4000 rpm durante 1 min. Los protoplastos se resuspendieron en 450 μl desolución II (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM EDTA). Se agregó 50 μl de SDS 10% y se incubó a 65°C por 30 min. Posteriormente seagregó 20 μl de proteinasa K a una concentración de 20 mg/ml y se incubó la mezcla a 55°C durante 1 hora. Se realizaron tresextracciones con fenol saturado en tampón Tris-HCl pH 7.4, dos extracciones con fenol: cloroformo:alcohol isoa-mílico (25:24:1) yuna con cloroformo: alcohol isoa-mílico (24:1), cadaEl DNA se precipitó con dos volúmenes de etanol absoluto a -20 °C, lavadocon etanol al 70 % y finalmente resuspendido en 50 μl de agua bidestilada estéril. El DNA fue analizado por electroforesis engeles de agarosa al 0,7 % en presencia de bromuro de etidio a una concentración final de 0,5 μg/ml (Sambrook et al., 1989).