Transcription Mediated Amplification-TMA
Páginas: 10 (2421 palabras)
Publicado: 21 de marzo de 2013
La amplificación mediada por transcripción (Transcription Mediated Amplification-TMA) es un método isotermal que se basa en la amplificación de ácidos nucleicos a mil millones de copias en menos de una hora (15-30 minutos) mediante la transcripción de ARN y la síntesis de ADN para de esta forma producir un amplicon de ARN. Puede ser utilizado para amplificar secuencias de ARN o ADN y hademostrado su utilidad en la detección de Mycobacterium tuberculosis y Chlamydia trachomatis.
Desarrollada en Gen-Probe, este tecnología usa dos “primers” y dos encimas. Las dos encimas que utiliza son la ARN polimerasa para llevar a cabo la transcripción de ARN y la transcriptasa en reverso para que realice la síntesis de ADN.
Los pasos son:
Uno de los “primers” tiene una secuencia promotora parala ARN polimerasa y en el primer paso del proceso de amplificación este “primer” se hibridiza al rARN de interés en un sitio definido.
La transcriptasa en reverso crea una copia de ADN a partir del rARN de interés mediante la extensión desde el extremo 3’ del “primer” con la secuencia promotora para la ARN polimerasa.
La cadena de ARN presente en la doble hebra ARN:ADN es degradada por laactividad de RNasa de la transcriptasa en reverso.
Un segundo “primer” se pega a la copia de ADN.
Una nueva cadena de ADN es sintetizada desde el extremo 3’ del segundo “primer” por la transcriptasa en reverso creando una molécula de ADN de doble cadena.
La ARN polimerasa reconoce la secuencia promotora para la ARN polimerasa que tenia el primer “primer” añadido y que se encuentra ahora en el ADN einicia la transcripción.
Cada uno de los amplicones de ARN recién sintetizados entran de nuevo al proceso de amplificación mediada por transcripción y sirven como molde para una nueva ronda de replicación.
Los amplicones producidos son detectados por el ensayo de protección de hibridación (Hybridization Protection Assay-HPA), donde se usan sondas de ADN altamente específicas y marcadas conmoléculas quimioluminiscentes para la detección de ARN.
En comparación con el “Polimerase Chain Reaction (PCR)” y “Ligase Chain Reaction (LCR)”, el “Transcription Mediated Amplification (TMA)”:
Es isotermal y por tanto no hay que estar calentando y enfriando como en el PCR; un baño de agua o bloque de calor se utiliza en vez de un ciclador termal.
Produce amplicones de ARN en vez de amplicones deADN. Dado que el ARN es más lábil en el ambiente de laboratorio que el ADN se reduce la posibilidad de contaminación arrastrada.
Produce 100-1000 copias por ciclo en contraste con PCR y LCR que producen solo dos copias por ciclo. Esto resulta en 10 mil millones de copias dentro de aproximadamente 15-30 minutos.
Si el blanco es rARN (del cual hay miles de copias por bacteria) la sensibilidad delmétodo es muy superior.
El “AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct (MTD) Test” es una prueba donde el ácido nucleico de interés (rARN) es amplificado para la detección diagnostica in vitro del rARN del complejo Mycobacterium tuberculosis en frotis positivos y negativos de sedimentos concentrados preparados a partir de muestras de esputo (inducida o expectorada), bronquiales (lavados broncoalveolares o aspirados bronquiales) o aspirados traqueales para bacilos ácido resistentes. Utiliza la amplificación mediada por transcripción (TMA) y el ensayo de protección de hibridación (HPA) para detectar cualitativamente dentro de 2.5 a 3.5 horas después de comenzar el procedimiento el rARN del complejo Mycobacterium tuberculosis. Con esta prueba no se puede determinar la susceptibilidad adrogas pero proporciona una detección rápida y segura. La prueba se compone de dos partes que se llevan a cabo en un solo tubo. En la primera parte utilizando la metodología de la amplificación mediada por transcripción (TMA) se amplifica un rRNA específico de micobacterias mediante la transcripción de los intermediarios de ADN resultando en múltiples copias del amplicon de ARN micobacteriano. En...
Desarrollada en Gen-Probe, este tecnología usa dos “primers” y dos encimas. Las dos encimas que utiliza son la ARN polimerasa para llevar a cabo la transcripción de ARN y la transcriptasa en reverso para que realice la síntesis de ADN.
Los pasos son:
Uno de los “primers” tiene una secuencia promotora parala ARN polimerasa y en el primer paso del proceso de amplificación este “primer” se hibridiza al rARN de interés en un sitio definido.
La transcriptasa en reverso crea una copia de ADN a partir del rARN de interés mediante la extensión desde el extremo 3’ del “primer” con la secuencia promotora para la ARN polimerasa.
La cadena de ARN presente en la doble hebra ARN:ADN es degradada por laactividad de RNasa de la transcriptasa en reverso.
Un segundo “primer” se pega a la copia de ADN.
Una nueva cadena de ADN es sintetizada desde el extremo 3’ del segundo “primer” por la transcriptasa en reverso creando una molécula de ADN de doble cadena.
La ARN polimerasa reconoce la secuencia promotora para la ARN polimerasa que tenia el primer “primer” añadido y que se encuentra ahora en el ADN einicia la transcripción.
Cada uno de los amplicones de ARN recién sintetizados entran de nuevo al proceso de amplificación mediada por transcripción y sirven como molde para una nueva ronda de replicación.
Los amplicones producidos son detectados por el ensayo de protección de hibridación (Hybridization Protection Assay-HPA), donde se usan sondas de ADN altamente específicas y marcadas conmoléculas quimioluminiscentes para la detección de ARN.
En comparación con el “Polimerase Chain Reaction (PCR)” y “Ligase Chain Reaction (LCR)”, el “Transcription Mediated Amplification (TMA)”:
Es isotermal y por tanto no hay que estar calentando y enfriando como en el PCR; un baño de agua o bloque de calor se utiliza en vez de un ciclador termal.
Produce amplicones de ARN en vez de amplicones deADN. Dado que el ARN es más lábil en el ambiente de laboratorio que el ADN se reduce la posibilidad de contaminación arrastrada.
Produce 100-1000 copias por ciclo en contraste con PCR y LCR que producen solo dos copias por ciclo. Esto resulta en 10 mil millones de copias dentro de aproximadamente 15-30 minutos.
Si el blanco es rARN (del cual hay miles de copias por bacteria) la sensibilidad delmétodo es muy superior.
El “AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct (MTD) Test” es una prueba donde el ácido nucleico de interés (rARN) es amplificado para la detección diagnostica in vitro del rARN del complejo Mycobacterium tuberculosis en frotis positivos y negativos de sedimentos concentrados preparados a partir de muestras de esputo (inducida o expectorada), bronquiales (lavados broncoalveolares o aspirados bronquiales) o aspirados traqueales para bacilos ácido resistentes. Utiliza la amplificación mediada por transcripción (TMA) y el ensayo de protección de hibridación (HPA) para detectar cualitativamente dentro de 2.5 a 3.5 horas después de comenzar el procedimiento el rARN del complejo Mycobacterium tuberculosis. Con esta prueba no se puede determinar la susceptibilidad adrogas pero proporciona una detección rápida y segura. La prueba se compone de dos partes que se llevan a cabo en un solo tubo. En la primera parte utilizando la metodología de la amplificación mediada por transcripción (TMA) se amplifica un rRNA específico de micobacterias mediante la transcripción de los intermediarios de ADN resultando en múltiples copias del amplicon de ARN micobacteriano. En...
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