TRANSFERENCIA DEL MATERIAL GENÉTICO

TRANSFERENCIA DEL MATERIAL GENÉTICO II:
AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS

Introducción

Los métodos para llevar a cabo el aislamiento de plásmidos toman en cuenta las diferencias topológicas entre los plásmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, así como el tamaño de ambos.


Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA del plásmido circular serompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas del DNA se liberan completamente. Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de ADN cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución, lafidelidad de la reasiociación es substancialmente diferente para ambas moléculas. La renaturalización de los plásmidos circulares es rápida debido a que las cadenas están próximas, mientras que en las moléculas lineares de DNA lo hacen menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensión por centrifugación el plásmido pertenece en la solución y puede serprecipitado con alcohol después de que el DNA cromosomal ha sido removido.

La técnica miniprep, para extraer DNA plasmidídico bacteriano, se basa en la lisis alcalina. Las células son lisadas en condiciones alcalinas, que desnaturaliza tanto ácidos nucléicos como proteínas que después es neutralizada con acetato de potasio, con ello se logra la precipitación del DNA cromosomal y de las proteínasya que estas moléculas no se renaturalizan de manera correcta. Los plásmidos se renaturalizan de manera idónea y permanecen en la solución, separándolo de esta manera efectivamente del DNA cromosomal y de las proteínas.

Objetivos

Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA genómico.
Realizar el aislamiento del DNA plasmídico.

Hipótesis

Yaque el plásmido bacteriano se encuentra fuera del cromosoma y posee una forma y tamaño bastante diferente al DNA cromosomal y a otras proteínas extracromosomales, es posible su purificación mediante técnicas que faciliten su desnaturalización y renaturalización pero que no permiten que otras moléculas lo hagan.

Resultados

Con el fin de comprobar que se aisló el plásmido de las célulasbacterianas, se realizaron lecturas en el espectrofotómetro específicas para cada molécula que se ve afectada por el aislamiento (proteínas y DNA).

Molécula
Absorbancia
Dilución
DNA =260
0.107
15L en 585L de agua
Proteínas =280nm
0.010
15L en 585L de agua

AQUÍ FALTA TMB TODOS LOS CÁLCULOS QUE TIENE ATZI PARA LA CUANTIFICACION Y LO DE LA RELACION Y ESO

Discusión

Castro RodríguezGabriela Verenice

Se realizó la lectura de lo obtenido después del proceso de aislamiento a dos diferentes absorbacias (260 y 280), esto con el fin de conocer que concentración de DNA se obtuvo, pues este presenta su máxima absorbancia a 260. La lectura a 280 se lleva a cabo para saber si existe una mayor cantidad de proteínas que de ADN, ya que ambas moléculas se encuentran fuera delcromosoma y estas últimas pueden contaminar la muestra de plásmido.

El plásmido fue purificado correctamente, es decir hay muy poca cantidad de proteínas, ya que a 280 la absorbancia fue de 0.010. Además sólo se necesitaron 15ul para lograr una absorbacia adecuada a 260nm.


Mercado Alquicira Carmen

Se llevo a cabo una transformación bacteriana con el objetivo de que una bacteria adquiriera DNAde otra bacteria por medio de un choque térmico, paso determinante para que se lleve a cabo dicho procedimiento de transferencia de material genético.
Lo anterior fue realizado mediante el uso de células competentes, para posteriormente obtener células transformantes y para verificar que se llevó a cabo la transformación, se procedió a sembrar la “mezcla” de células transformadas en un medio...